| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
異丙醇
醋酸鉀（5 mol/L )
SDS (10%, m/V)
醋酸鈉（3 mol/L，pH 7.0)
山梨糖醇緩沖液
TE ( pH 7.4)
含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0 )
酵母重懸浮緩沖液
2. 酶及其緩沖液
酶解酶 100T
3. 培養基
YFD 培養基
4. 離心機及其轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或同類產品
5. 專用設備
預置至 65℃ 的水浴
6. 載體及酵母細胞株
酵母細胞
二、方法
細胞培養及其 DNA 的抽提
1. 用 10 ml YPD 培養基培養酵母。將酵母培養物在 30℃、中度振蕩條件下培養過夜。
2. 取 5 ml 培養細胞置于離心管中。2000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，4100 r/min）離心 5 min, 收集細胞。將剩下培養物置于 4℃ 儲存。
3. 用 0.5 ml 山梨糖醇緩沖液重新懸浮細胞。將細胞懸液轉移到一只微量離心管中。
4. 加入 20 μl 酶解酶 100T 的溶液（用山梨糖醇緩沖液配成 2.5 mg/ml 濃度)。將細胞懸液在 37℃ 下溫育 1 h。
5. 用微量離心機離心 1 min, 收集細胞，吸棄上清液。
6. 用 0.5 ml 酵母重懸緩沖液重新懸浮細胞。
7. 加入 50 μl 10% 的 SDS。蓋上管蓋，將離心管快速地翻轉數次，混勻后將離心管在 65℃ 下溫育 30 min。
8. 加入 0.2 ml 5 mol/L 的醋酸鉀溶液，冰浴 1 h。
DNA 的分離
9. 在微量離心機中以最大轉速 4℃ 離心 5 min, 使細胞碎片沉積下來。
10. 室溫下用粗孔吸頭吸取離心上清，轉移到一個新的微量離心管中。
11. 加入等體積室溫下的異丙醇，沉淀核酸。將管內容物混勻，室溫下放置 5 min。
12. 在微量離心機中以最大轉速離心 10 s 回收核酸沉淀。吸去離心上清液，將沉淀在空氣中干燥 10 min。
13. 用 300 μl 含 20 μg/ml 胰 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解沉淀。將消化混合物在 37℃ 溫育 30 min。
14. 加入 30 μl 3 mol/L 的醋酸鈉（pH 7.0）。混勻后，加入 0.2 ml 的異丙醇。再次進行混勻。在微量離心機中以最大轉速離心 20 s, 使 DNA 沉淀。
15. 吸去上清液，沉淀在空氣中干燥 10 min, 用 150 μl TE ( pH 7.0）溶解 DNA。 |
|---|
