用S1核酸酶對RNA作圖

T4 噬菌體多聚核苷酸激酶大腸桿菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段S1 核酸酶S1 核酸酶消化緩沖液限制性核酸內切酶載體 RNA標準 RNA單鏈 RNADNA 探針

過硫酸銨復性緩沖液乙醇凝膠洗脫緩沖液RNA 雜交緩沖液S1 核酸酶終止緩沖液苯酚氯仿RNA 加樣緩沖液乙酸鈉TE四甲基乙二胺三氯乙酸

變性聚丙烯酰胺凝膠水浴Whatman 3 MM 濾紙

一、材料

1. 緩沖液和溶液

過硫酸銨（10%)

10X 復性緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，100 mmol/L MgCl₂，0.5 mol/L NaCl，100 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT））

乙醇

凝膠洗脫緩沖液（0.5 mol/L 乙酸銨，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.1% （m/V) SDS）

RNA 雜交緩沖液

S1 核酸酶終止緩沖液（4 mol/L 乙酸銨，50 mmol/L EDTA（pH 8.0），50 ug/ml 載體 RNA）

苯酚：氯仿（1:1，V/V）

RNA 加樣緩沖液

乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)

TE ( pH 7.6)

四甲基乙二胺（TEMED)

三氯乙酸（TCA）(1% 和 10%)

2. 酶和緩沖液

T4 噬菌體多聚核苷酸激酶

大腸桿菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段（10 單位/μl)

S1 核酸酶（與 S1 核酸酶消化緩沖液一起使用）

S1 核酸酶消化緩沖液（0.28 mol/L NaCl，0.05 mol/L 乙酸鈉（pH 4.5)，4.5 mmol/L ZnSO₄·7H₂O）

限制性核酸內切酶

3. 凝膠

含 8 mol/L 尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠



4. 核酸和寡核苷酸

載體 RNA ( 酵母 tRNA)

含有四種 dNTP 的溶液（20 mmol/L)（用 25 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0) 溶解 dNTP，分裝成小份儲于 -20℃。）

標準 RNA

溶于蒸餾水中的合成寡核苷酸（10 pmol/μl )

模板 DNA ( 1 μg/μl），單鏈

單鏈 RNA

5. 探針

均勻標記且是單鏈的 DNA 探針

6. 放射性化合物

[γ-³²P] ATP（10 mCi/ml，3000 Ci/mmol）

7. 專用裝備

水浴，分別預設為 65℃，85℃，95℃，以得到適合的消化溫度以及理想的雜交溫度。

Whatman 3 MM 濾紙（或相當材料）


二、方法

隨機標記的單鏈 DNA 探針的制備

1. 制備含 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺微型凝膠（13 cm X 15 cm X 0.75 cm ) ( 例如 Bio-Rad Mini-Protean)

(1) 混勻下列試劑

7.2 g 尿素

1.5 ml 10X TBE

加入適當量的 40% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺 19:1）制備含有所需濃度的聚丙烯酰胺凝膠。

(2) 加水到終體積 15 ml

(3) 室溫下在磁力攪拌器上攪拌直至尿素溶解。再加入：

120 μl 10% 過硫酸銨

16 μl TEMED

快速混勻溶液并將膠倒入微型膠的模子。

2. 在膠凝結的過程中，混合下列試劑：

10 pmol ( 1 μl）未標記的寡核苷酸

10 μl [γ-³²P] ATP（10 mCi/ml，3000 Ci/mmol）

2 μl 10X 多核苷酸激酶緩沖液

6 μl H₂O

10 單位（1 μl）多核苷酸激酶

將反應混合物 37℃ 溫育 45 min，再 95℃ 溫育 3 min 滅活多核苷酸激酶。

3. 向激酶反應中加入：

2 μl（2 μg）單鏈 DNA 模板

4 μl 10X 復性緩沖液

14 μl H₂O

將反應混合物 65℃ 溫育 10 min，再冷卻到室溫。

4. 向第 3 步的反應混合物加入：

4 μl dNTP 混合物

1 μl (10 單位）大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段

將反應混合物室溫溫育 15 min，再 65℃ 溫育 3 min 滅活 DNA 聚合酶。

5. 調整反應混合物的離子組成和 pH 值以適應限制性酶。加入 20 單位限制性酶，于適當溫度消化 2 h。

6. 向限制性核酸內切酶消化反應中加入：

2 μl 載體 RNA

5 μl 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.2)

用標準的乙醇沉淀法回收 DNA 探針。

7. 用 20 μl 凝膠上樣緩沖液溶解 DNA，95℃ 溫育 5 min 使之變性，然后快速冷卻到 0℃。

用凝膠電泳純化探針

8. 當 DNA 在 95℃ 溫育時，清洗凝膠的加樣孔除去尿素，立刻加入探針。

9. 電泳直至溴酚藍到達凝膠的底部（200 mA 約 30 min)。

10. 除去灌膠裝置，讓膠貼附在底層玻璃板上。用塑料膜（例如 Saran 膜）包裹凝膠和玻璃板。確保膠和塑料膜間沒有氣泡。

注意：撬開玻璃片時，戴上保護眼睛的裝置。

11. 讓凝膠在 X 線片上曝光。在膠片上作出玻板角和邊的永久的記號。同時作出溴酚藍和二甲苯腈藍位置的記號。

通常 2~10 min 的曝光足夠得到放射標記探針的圖像。

12. 分開玻璃板和膠片，用手術刀除去放射標記的條帶。將切過的膠在一張新的膠片上曝光，以保證含有正確分子大小條帶的凝膠區域確實被切下來。

13. 將切下的凝膠片段轉入滅菌的微離心管中，加入恰好足夠體積的凝膠洗脫緩沖液蓋住凝膠（250~500 μl)。將蓋上的離心管在搖床上室溫過夜。

14. 最大轉速離心 5 min。

15. 用自動的吸量裝置將上清轉入新的離心管中，注意不要吸入聚丙烯酰胺。標記的探針用液閃分光鏡檢測應為大約 10000 cpm/μl。

16. -70℃ 保存探針。



待測 RNA 和放射標記的 DNA 探針間的雜交

17. 將 0.5~150 μg 的 RNA ( 待測的和標準的）平均分入每一個滅菌的微型離心管中。向每一個管中加入過量的均勻標記的單鏈 DNA 探針。

18. 加入 10% 體積的 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.2)，2.5 倍體積的冰冷的乙醇，沉淀 RNA 和 DNA。0℃ 放置 30 min，最大轉速 4℃ 離心 15 min 回收核酸。去除乙醇的上清，用 70% 的乙醇洗滌，再次離心。小心的除去所有的乙醇，將含有 RNA 和 DNA 的沉淀室溫放置直至乙醇的殘跡蒸發。



19. 用 30 μl 雜交緩沖液溶解核酸沉淀。吹吸幾次以保證沉淀徹底溶解。

20. 將離心管的蓋蓋緊，將雜交反應在 85℃ 水浴溫育 10 min 使核酸變性。

21. 快速將離心管轉移到調至雜交溫度（通常 65℃）的水浴中。轉移過程中，不要讓離心管冷卻到低于雜交的溫度。在選定的溫度下，將 DNA 和 RNA 雜交 12~16 h。

S1 核酸酶消化 DNA-RNA 雜合體

22. 注意保持離心管浸沒在水中，打開管蓋。快速加入 300 μl 冰冷的 S1 核酸酶消化緩沖液，并立即將離心管從水浴中拿出。溫和振蕩以混勻離心管中物質，再將離心管轉移到調至 S1 核酸酶消化溫度的水浴中。根據所需要的消化程度，溫育 1~2 h。



23. 將反應體系冷至 0℃。加入 80 μl S1 核酸酶終止緩沖液并振蕩混勻溶液。

24. 用苯酚：氯仿萃取反應體系一次。反應體系在微型離心管中以最大轉速室溫離心 2 min，將上淸轉到另一個離心管中。加入兩倍體積的乙醇，混勻，-20℃ 放置 1 h。

25. 以最大轉速 4℃ 離心 15 min 回收核酸。小心的除去所有的上清，將打開的離心管在室溫放置直到可見的乙醇殘跡蒸發掉。

用凝膠電泳分析 S1 核酸酶產物

26. 用 4 μl TE 緩沖液（pH 7.6) 溶解核酸沉淀。加入 6 μl 上樣緩沖液并混勻。

27. 95℃ 溫育核酸 5 min，立即轉移到冰上。稍微離心使樣品聚集在離心管的底部。

28. 用聚丙烯酰胺 8 mol/L 尿素的凝膠電泳檢驗放射標記的 DNA。

29. 當示蹤染料在膠上移動了適當的距離后，關掉電源拆卸電泳裝置。輕輕的橇開大玻璃板的一角并將大玻璃板從膠上移開。為確定方向，切下膠的一角。

30. 將含有膠的玻璃板轉移到含過量的 10% 三氯乙酸的托盤中。室溫下輕微晃動托盤 10 min。

31. 將 10% 的三氯乙酸溶液倒掉，換過量的 1% 三氯乙酸。室溫搖動 5 min。

32. 倒掉 1% 的三氯乙酸溶液，用去離子水輕微的漂洗一下已被固定的膠。將玻璃板和膠一起拿出托盤，放在平的地方。用紙巾除去多余的水。

33. 剪下每一邊都比膠長 1 cm 的 Whatman 3 MM 濾紙（或相同材料）。將紙置于膠的上面再將玻璃板顛倒過來從而把膠轉移到濾紙上。

34. 移去玻璃板，把膠放在凝膠干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。

35. 獲得干膠的放射自顯影圖。用光密度測定法或磷光成像法掃描圖像，或者切下含有片段的凝膠用液閃分光光度計計量。