基因表達的系列分析實驗

玻璃及塑料器皿

溶液與緩沖液引物

試劑盒MPC-EPCR儀Gene PulserII 型系統

一、一般原則

若用于 SAGE 的 RNA 有足夠的量，最好用 2.5~5 ug polyA+RNA, 可按實驗方案 A 進行。這里我們還提供了實驗方案 B，它在多個步驟上已做了修改，適用于僅有微量的原材料（例如，利用這個流程我們能從來自于 300fxm 腦切片的海馬樣品中獲得基因表達譜)。后一實驗方案尤適用研究神經組織表達，由于其復雜的神經環路及高度特化的結構，獲得大量均質組織以分離 RNA 往往是不可能的。

下面對兩組實驗方案第 1 步到第 8 步進行了詳細的描述，從第 9 步起兩組方案步驟相同。

二、mRNA 的分離

實驗方案 A

許多試劑盒分離 PdyA+RNA 的效果都很好，我們推薦使用 mRNADIRECT 試劑盒（Dynal;610.11) 來從組織中或培養的細胞中分離 polyA+RNA，或者用 mRNA 純化試劑盒（Dynal;610.01) 從總 RNA 中分離 pdyA+RNA。在試劑盒說明書中對所有步驟有詳細的描述。

實驗方案 B

1.TRIzol 分離總 RNA(見 DD 實驗方案)。

2.在 RNA 沉淀后，將 1~10 噸總 RNA 重懸于 20 ul 裂解緩沖液中（mRNA 捕獲試劑盒)。

注意：我們用更少量的總 RNA 也可成功地提取 mRNA，但這要求在 SAGE 后面的步驟中進行一些修改。

3.稀釋 20X 生物素化的 oligo(dT)20 引物（mRNA 捕獲試劑盒）到最終濃度為 5Pmol/ul。

4.將 4 ul 稀釋的引物加入到含有 RNA 的裂解緩沖液中。

5.在 37℃ 退火 5 min。

6.轉移 RNA 到一個鏈霉抗生物素包被的 PCR 管中（mRNA 捕獲試劑盒)。

7.在 37℃ 保溫孵育 3 min(在此步中通過鏈球菌素-生物素結合 mRNA 被固定于試管壁上)。

8.移去管中溶液（含有未結合的 RNA 片段：rRNA、tRNA 等)，用 50 ul 洗液小心地沖洗試管 3 次（mRNA 捕獲試劑盒)。

9.去除洗液。

10.立即進行 cDNA 合成步驟。

三、cDNA 合成

實驗方案 A

1.以 oligo(dT)-引物加入 2.5~5 ug polyA+RNA 合成 cDNA。

2.在 0.5 mlPCR 管中混合（冰上操作）：

—2.5 ul polyA+RNA(1 ug/ul)

一 4 ul 5X 第一^緩沖液

—2 ul 0.lmol/LDTT

—1 ul 10 mmol/LdNTPs

一 1 ul oligo(dT)18(生物素化的）（0.5ug/ul)

一 1 ul SuperScriptHRT(200ug/ul)

—8.5 ul DEPC 水

總體積為 20 ul。

3.42℃ 孵育 2 h(可在 PCR 儀中進行)。

4.在冰上加單鏈 cDNA 進行第二鏈合成：

—(20 ul 單鏈 cDNA)

一 16 ul 5x 第二鏈緩沖液

—1.6 ul 10 mmol/LdNTPs

—2 ul DNA 多聚酶 I(10u/ul)

—1 ul T4DNA 連接酶（5u/ul）

—1 ul RNase H(5u/ul)

一 38.4 ul 重蒸（餾）水

總體積為 80 ul。

5.在 16℃ 孵育 2 h。

6.用 LoTE 擴容至 200ul。

7.加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)(PCI)。

8.振蕩。

9.在 4°C 微量離心機中以 13OOOr/min 離心 5 min。

10.轉移上層水相至一新 1.5 ml Eppendorf 試管中。

11.乙醇沉淀：

—3 ul 糖原

一 100 ul 10 mmol/L 乙酸銨

一 700 ul 乙醇

12.置于-20°C 下 30 min。

13.在 4”C，在微量離心機中以 13OOOr/min 離心 15 min。

14.以 500 ul 70% 乙醇有力振蕩沖洗沉淀兩遍。

15.去除 70% 乙醇，讓沉淀物在空氣中風干約 15 min。

16.將沉淀重新懸浮于 20 ul LoTE 中。

實驗方案 B

注意：用來捕獲 PolyA+RNA 并將其固定到試管壁上（實驗方案 B，第 1 步）的 oligo(dT)2a 引物（生物素化，mRNA 捕獲試劑盒)，可直接作為 cDNA 合成的引物，cDNA 合成后持續結合于試管壁上，直到第六步通過 TE 消化釋放。

1.用 50 ul 1 第一鏈緩沖液沖洗捕獲 PolyA+RNA 的試管，然后移去緩沖液。

2.用下述步驟代替 IX 第一鏈緩沖液（在冰上移液)：

—4 ul 的 5X 第一鏈緩沖液

一 2 ul 的 0.1mol/L TT

一 I ul 的 10 mmol/LdNTPs

一 1 ul 的 SuperScriptII RT (200 U/ul)

—12 ul DEPC 水

總體積為 20ul。

3.42℃ 下孵育 2 h（在 PCR 儀進行)。

4.從試管中移去反應混合物，并以 50 的 IX 第二鏈緩沖液洗滌試管 1 次 (mRNA 捕獲試劑盒)。

5.移去沖洗液，用 5 〇 4 的 IX 第二鏈緩沖液洗滌試管 1 次。

6.用下述溶液替代 IX 第一鏈緩沖液

一 4 ul5X 第二鏈緩沖液

_0.4ul 的 IOmmol/LdNTPs

—Iul DNA 多聚酶 I (10 U/pl)

—0.5ulT4DNA 連接酶（5U/-)

—0.5ul RNaseH(5U//^l)

—13.6 ul 蒸餾水

總體積為 20ul。

7.在 16℃ 下孵育 2 h。

雙鏈 cDNA 可保存于-20℃, 或者直接在下一步中應用（以錨定酶消化 cDNA)。