多色熒光原位雜交實驗

DAPI 復染液乙醇SSC鹽酸HClNP-40胰酶NaCl檸檬酸鈉Spectra Vysion探針M-FISH 探針

一、染色體標本制備

1.標本制備：不同標本來源的樣品（血液、羊水、成纖維細胞培養物或骨髓）用其相應的標準程序進行制備。

2.用相差顯微鏡找到合適的中期染色體分裂相，將雜交區域標記出來。

3.將標本立在 37°C 裝有 40 mL 胰酶工作液的染色缸中作用 2 min。

4.在一個 HYBrite(Vysis) 裝置中人工老化片子，90°C、2 min。

5.在 HYBrite(Vysis) 裝置中用 2XSSC 沖洗片子 2 min。

6.將標本在分別盛有 40 mL70%、85% 和 100% 乙醇系列的染色缸中室溫下依次脫水 lmin，風干。

二、雜交和洗脫

1.將 M-FISH 探針混合液（Vysis) 加到標記的雜交區域上。

2.將每張標本的雜交區域上覆以蓋片，用橡皮泥在蓋片周圍封片。

3.將標本固定在加濕的 HYBrite(Vysis) 裝置中，設置為：變性溫度 80°C，時間為 3 min，雜交溫度 37°C，雜交時間最少 16 h。

4.將標本在盛有 40 mL0.4XSSC 染色缸中 70°C 條件下洗片 1?2 min，用流動的去離子水洗片 2s。

5.將標本移入盛有 40 mL2XSSC/0.1%NP-40 溶液的染色缸中，室溫下作用 IOs06. 每個雜交區域上加 10% 的 DAPI 復染液后蓋上蓋片，注意不要封片。

1.不論新鮮制備的標本還是標本顯帶后相繼M-FISH，將M-FISH的探針(Vysis，DownerGrove，IL)加到雜交區域上，蓋上蓋玻片并用橡皮泥封片，然后將玻片放入濕的Hybrite中，其設置如下：解鏈溫度80℃、3min，雜交溫度37℃，至少16h。通常新鮮制備的標本M-FISH雜交結果較好，因為G帶通常要進行人工老化。

2.進行M-FISH分析時需要考慮的很重要的一點是：靶位點雜交和非特異結合的對比度。如果對比度較差，染色體分類顏色也將會不顯著，對比度對遠紅外熒光尤其重要。加長胰酶處理時間有助于提高對比度，而處理時間過長將會導致染色體DNA和信號丟失，從而使染色體顏色暗淡。雜交盒濕度不夠將會使雜交試劑脫水濃縮，這將會導致探針和染色體DNA隨機雜交（松散結合），叢而使對比度下降。

3.獲得理想結果的另一個重要因素是染色體形態。染色體形態不好將使DAPI帶型轉化為灰度時很難解釋，也可導致染色體顏色從一條染色體流入另一條染色體。導致染色體形態不好的最常見原因是老化不充分，人工老化或將片子用熱的2XSSC處理2min有助于改善染色體形態。通常用去離子水室溫下沖洗標本繼以DAPI復染也可以改善帶型，但會降低雜交強度。增加老化或加長2XSSC預處理時間也會減少雜交強度。染色體形態不好也可能由過度變性引起。染色體形態很好但雜交效果很差通常提示標本過度老化、過久的2XSSC處理或變性不足。制備的標本較臟，玻片上留有較多的背景殘片也會使結果受到不好的影響。明亮的熒光殘片將使曝光時間縮短，影響染色體分類，用德克薩斯紅時這種現象尤為明顯。在人工操作模式下，加長標本的德克薩斯紅平面曝光時間可使這個問題得以解決。

4.有時即使經過最大的努力，試劑或程序完全正確還是很難得到最理想的結果。這時就需要分別觀察每個光平面，將之與制造商提供的表對比。例如，22號染色體（淺綠、紅、綠）有時會被錯劃為3號（淺綠）染色體，可以分別觀察紅、綠光平面來確定這兩種光譜是否存在，從而確定所觀察染色體是不是22號染色體。

5.在染色體間相互易位和染色體重疊中，由于熒光素相互重疊，斷裂和融合的交界處進行染色體區分時常常提示有第三條染色體或該區域變成灰色（圖50。當易位片段很小時上述情況就很重要，根據觀察到的顏色分類，將所有可能的染色體都考慮進來。例如，一個衍生的7號染色體從12號染色體上易位來一個片段，可能會被劃為19號染色質（圖5D)，因為7號染色體的標記為遠紅外（farred)，12號為金黃色和綠色（goldandgreen)，因此三種顏色組合（遠紅外、金黃色和綠色）正好是19號染色體的特征。因此要解決這個問題，我們必須用12號染色體wcp探針對樣品進行分析，結果陽性可斷定易位片段來源為12號染色體，結果陰性則可斷定片段來源為19號染色體。當熒光組合超出分類系統的范圍也會顯示為灰色區域，例如，20號（遠紅外、淺綠色和紅色）和21(金黃色和淺綠色）號染色體重疊結果產生一個4種顏色的組合（遠紅外、淺綠色、紅色和金黃色），就會出現一個灰色區域，因為沒有哪條染色體的顏色組合多于3種。

6.當衍生染色體的熒光光譜包含易位染色體的所有熒光素特征時，小的易位，特別是插人尤其容易被錯讀。舉個例子，當1號染色體（金黃色）的小片段易位至5號染色體（金黃色和遠紅外），整條染色體看起來還像是5號染色體，單獨使用1號染色體涂染探針就可以解決此問題。

7.組成性異染色質，包括富含a衛星的片段和富含重復DNA序列的近端著絲粒短臂，可以用未標記的Cot1-DNA封閉掉或探針中不包含其互補序列。這些區域也變成灰色或隨機施以假色并進行分類（圖5C)，在分析標記染色體或衍生染色體時必須謹記此現象。M-FISH的其他一些局限包括：不能檢測大多數的染色體內異常（如倒位）和不大于3Mb的染色體間異常。