向平末端DNA連接合成接頭實驗

T4 噬菌體連接酶T4 噬菌體多聚核苷酸激酶限制性內切核酸酶外源或目的 DNA 片段

乙酸胺ATP乙醇10X 接頭激酶緩沖液MgCl2二硫蘇糖醇（DTT)牛血清白蛋白苯酚氯仿乙酸鈉TE

10% 聚丙烯酰胺凝膠或 0.7% 瓊脂糖凝膠

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙酸胺（4 mol/L，pH 4.8)，ATP ( 5 mmol/L 和 10 mmol/L)（如果連接緩沖液中已有 ATP，則在步驟 2 中省去添加 5 mmol/L ATP），乙醇，10X 接頭激酶緩沖液（600 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6），100 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT)，2 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）），苯酚：氯仿（1:1，V/V)，乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。

2. 酶和緩沖液

T4 噬菌體連接酶，T4 噬菌體多聚核苷酸激酶，限制性內切核酸酶。

3. 凝膠

10% 聚丙烯酰胺凝膠，或 0.7% 瓊脂糖凝膠。

4. 核酸和寡核苷酸

外源或目的 DNA 片段（平末端），人工合成的接頭，TE 溶解，濃度為 400 μg/ml。

5. 放射性標記物

[ y-³²P] ATP（1~10 μCi）。

6. 專用設備

柱旋轉層析裝置，溫度可調至 65℃ 的水浴裝置。

二、方法

1. 接頭的磷酸化（如需要）

(1) 在一個無菌的 0.5 ml 離心管中加入下列反應混合物：10X 接頭激酶緩沖液 1.0 μl，10 mmol/L ATP 1.0 μl，人工合成的接頭 [ TE ( pH 8.0) 溶解 ] 2.0 μg，H₂O 補至 9 μl，T4 噬菌體多聚核苷酸激酶 10 單位，12 個堿基的接頭約 250 pmol，反應物于 37℃ 溫育 1 h。

如有必要，此時應進行目的 DNA 內部酶切位點的甲基化。甲基化處理按銷售者的指導在連接接頭之前完成。

2. 磷酸化接頭與 DNA 平末端的連接

(1) 計算 DNA 平末端在制備物中的濃度，然后在一個 0.5 ml 離心管中加入下列連接反應混合物：50 μg 的 1 kb 長雙鏈 DNA 片段=78.7 nmol 或 157.4 nmol/L 的末端；平末端 DNA 2 pmol 末端；磷酸化接頭 150~200 pmol 末端；H₂O 補至 7.5 μl；10X 連接酶緩沖液 1.0 μl；5 mmol/L ATP 1.0 μl；T4 噬菌體 DNA 連接酶 1.0 Weiss 單位。

反應混合物于 4℃ 溫育 12~16 h。

(2) 反應混合物于 65℃ 溫育 15 min 以滅活 T4 噬菌體 DNA 連接酶。

(3) 讓連接反應混合物冷至室溫，然后加入：10x 內切酶緩沖液 10 μl；限制性內切核酸酶 50 單位；滅菌水補至 100 μl。

反應物于 37℃ 溫育 1~3 h。

3. 連接產物（DNA）的回收

(1) 用苯酚：氯仿抽提純化出酶切 DNA 片段，然后加乙酸胺（終濃度為 2 mol/L)，再加 2 倍體積的乙醇以沉淀 DNA。

(2) 于 4℃ 用微量離心機高速離心 15 min 收集 DNA 沉淀，加 50 μl TE ( pH 8.0) 溶解沉淀。

(3) DNA 溶液通過離心層析柱以除去過量的接頭。

(4) 用乙醇沉淀回收 DNA，而后用 10~20 μl TE ( pH 8.0) 重新溶解沉淀。

經過修飾的 DNA 片段現在可以連入質粒（或噬菌體）載體（它們凸出末端與 DNA 片段由接頭引入的序列互補）。