可以用于批量制備感受態細胞，其轉化效率可達到 5X106~2X107 個轉化克隆/μg 超螺旋質粒 DNA。這個轉化效率對于方便地進行質粒中克隆已經足夠高了。用此方法制備的感受態細胞可以在 -70℃ 凍存。但隨著凍存期的延長，轉化效率會有所降低。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 可以用于批量制備感受態細胞，其轉化效率可達到 5X106~2X107 個轉化克隆/μg 超螺旋質粒 DNA。這個轉化效率對于方便地進行質粒中克隆已經足夠高了。用此方法制備的感受態細胞可以在 -70℃ 凍存。但隨著凍存期的延長，轉化效率會有所降低。 |
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| 實驗材料 | 質粒 DNA |
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| 試劑、試劑盒 | 標準的轉化緩沖液CaCl2·2H2OMgCl2-CaCl2 溶液LB 或 SOB 培養液SOB 瓊脂板SOC 培養液 |
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| 儀器、耗材 | Sorvall GSA 轉頭或與之相當的轉頭聚丙烯管水浴裝置 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) CaCl2·2H2O ( 1 mol/L)
制備感受態細胞時，取出 10 ml 貯存液加 90 ml 純水稀釋至 100 ml，用預先處理的 Nalgene 濾膜（0.45 μm 孔徑）過濾除菌，放置冰上。
或
標準的轉化緩沖液（TFB )
對許多大腸桿菌的菌株，用標準 TFB 代替 CaCl2 可獲得一致或更好的結果
(2) MgCl2-CaCl2 溶液，冰上預冷。
2. 培養基
(1) LB 或 SOB 培養液（培養最初的細菌生長物）
(2) SOB 瓊脂板，含 20 mmol/L MgSO4 和適當的抗生素。
標準的 SOB 瓊脂板含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培養液
每個轉化反應約需 1 ml。
3. 核酸和寡核苷酸
質粒 DNA ( 重組質粒）
4. 離心機和轉頭
Sorvall GSA 轉頭或與之相當的轉頭
5. 專用設備
(1) 聚丙烯管（50 mm)，冰上領冷
(2) 聚丙烯管（17X100 mm；Falcon 2059)，冰上預冷
(3) 可調至 42℃ 的水浴裝置。
二、方法
1. 制備感受態細胞
(1) 從 37℃ 培養 16~20 h 的平板中挑取一個單菌落（直徑 2~3 mm)，轉到一個含有 100 ml LB 或 SOB 培養基的 1 L 燒瓶中。于 37℃ 劇烈振搖培養 3 h。一般經驗，1OD600 約含有大腸桿菌 DH1 109 個/ml。
為達到高效轉化，活細胞數務必少于 108 個細胞/ml，對于大多數大腸桿菌來說，這相當于 OD600 值為 0.4 左右。為保證細菌培養物的生長密度不致過高，可每隔 15~20 min 測定 OD600 值來監測，用監測的時間及 OD600 值列一個圖表，以便預測培養物的 OD600 值達到 0.4 的時間，當 OD600 值達到 0.35 時，收獲細菌培養物。
在菌株與菌株之間，OD600 值與每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定腸桿菌的生長培養物在生長周期的不同時相的 OD600 值，并將各稀釋濃度的培養物鋪于無抗生素的 LB 瓊脂板以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度計讀數得到標準化。
(2) 將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放上 10 min，使培養物冷卻至 0℃。
(3) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 轉頭（或與之相當的轉頭）以 4100 r/min 離心 10 min，以回收細胞。
(4) 倒出培養液，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養液流盡。
(5) 每 50 ml 初始培養液用 30 ml 預冷的 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2 ) 重懸每份細胞沉淀。
(6) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 轉頭（或與之相當的轉頭）以 4100 r/min 離心 10 min，以回收細胞。
(7) 倒出培養液，將管倒置 1 min 以使最后的痕量培養液流盡。
(8) 每 50 ml 初始培養物用 2 ml 用冰預冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB）重懸每份細胞沉淀。
(9) 此時，可以按步驟 10~16 用新鮮制備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞凍存于 -70℃。（見 “制備和轉化感受態大腸桿菌的 Hanahan 方法 ( 高效的轉化策略 )”）。
對大多數大腸桿菌（MC106 除外)，在這一步采用 TFB 代替 CaCl2 可得到相同或更好的結果。
Dagert 和 Ehrlich 的實驗（1979 ) 曾表明，細胞可以于 4℃ 在 CaCl2 溶液中保存 24~48 h，在貯存的最初 12~24 h 內，轉化率增加 4~6 倍，然后降低到初始水平。
2. 轉化
包括陽性和陰性對照。
(10) 用冷卻的無菌吸頭從每份用 CaCl2 溶液制備的感受態細胞懸液中吸取 200 μl 轉移到無菌離心管（17X100 mm）中，每管加入 DNA（用不超過 10 μl 的體積，其中的 DNA 小于 50 ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置 30 min。
(11) 將管放入預加溫至 42℃ 的循環水浴中，恰恰放置 90 s，不要搖動管。
熱激是一個關鍵步驟，準確地達到熱激溫度非常重要。
(12) 快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻 1~2 min。
(13) 每管加 800 μl SOC 培養基，用水浴將培養基加溫至 37℃，然后將管轉移到搖床上，溫育 45 min，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
復蘇期中應于 37℃ 溫和地搖動細胞（用低于 50 r/min 轉速的搖床）。
如果用 α 互補篩選，請接 “用 X-gal 和 IPTG 篩選細菌菌落：α 互補” 鋪板。
(14) 將適當體積（每個 90 mm 平板達 200 μl）已轉化的感受態細胞轉移到含 20 mmol/L MgSO4 和相應抗生素的 SOB 瓊脂培養基上。
如果用四環素作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或軟瓊脂中），可以先在微量離心機上室溫離心 20s 以收集轉化菌，加 100 μl SOC 重懸沉淀，輕輕混勻。
重要：玻璃鋪菌器需先在乙醇中浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板表面。
如檢査氨芐青霉素的抗性，用轉化菌鋪平板時密度應較低（毎個 90 mm 平板不超過 104 菌落 )，于 37℃ 培養的時間不超過 20 h。氨芐青霉素抗性的轉化體可將 β-內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域的青霉素。這樣，鋪平板時密度過高或培養時間過長都會導致出現對氨芐青霉素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加與平皿上所加的細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞釋放生長抑制物質的緣故。
(15) 將平板置于室溫直至液體被吸收。
(16) 倒置平皿，于 37℃ 培養，12~16 h 后可出現菌落。 |
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