實驗目的是了解掌握檢測DNA 質量的方法以及DNA定量的方法；了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性內切酶操作。來源：《遺傳學實驗教程》
| 實驗方法原理 | 在pH值為8.0~8.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 |
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| 實驗材料 | 水稻DNABAC克隆DNA |
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| 試劑、試劑盒 | 瓊脂糖限制性內切酶DraIEcoRIEcoRVHindIII凝膠 |
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| 儀器、耗材 | 水浴鍋瓊脂糖電泳儀 |
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| 實驗步驟 | 1. 取10 μl DNA于0.8% 凝膠檢測；
2. 將DNA調節濃度至300-400 ng/μl ；
3. 仔細閱讀將所用的任何一種酶產品說明書，熟悉反應條件及酶切的貯存濃度（10U-50 U/μl）廠家配套試劑；
4. 計算據反應條件所需要的各種試劑準確用量：（0.5 ml tube中）
DNA(3-5 mM) 10 μl
buffer reaction ′10 1.5 μl
Enzyme (15 U/μl) 0.8 μl（冰上）
ddH2O 2.7 μl
混勻，短暫離心；
5. 37 ℃ 溫浴1-2 hrs (純DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；
6. 加入上樣緩沖液終止酶切反應，也可65 ℃加熱10 min使酶變性失活；
7. 電泳檢測酶切效率：
每個樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點樣方法同上。 收起 |
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| 注意事項 |
1.酶解不一定要過夜,不過反應時間越長所用的酶量就越少。與用酶解鑒定載體/插
入片段相比,酶解基因組DNA所用酶濃度要高一些,一般1μg基因組DNA需加入5U內切酶。
2.若電泳條帶靠近加樣孔的一端比另一端亮得多,表明酶切不完全。這可能是因為:①反應時間不夠長(若反應過夜則可排除此項);②酶量不夠或酶部分失活;③如果初始DNA樣品溶于TE緩沖液中且在酶解反應中所占的體積較大時,TE緩沖液中的EDTA可能抑制酶解反應,這時可以用乙醇重新沉淀DNA,然后溶于少量TE緩沖液或SWD中。
3.選用的DNA相對分子質量其涵蓋的相對分子質量范圍要大,如λHindⅢ可涵蓋500bp到23kb的范圍。
4.DNA樣品經消化后在各泳道中條帶的亮度應一致,否則表明各樣品濃度不一致。DNA濃度通常難以精確測定,可以通過調節上樣體積來調節DNA的上樣量。 |
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