cDNA文庫的構建和篩選

一、材料

所有化學試劑均為分子生物學級純度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸頭均經高壓蒸氣滅菌。涉及核酸的操作均需帶手套。

1.總 RNA提取

（1）無 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich) 到 I L 水中(0.1%， V/V) , 攪 拌 過 夜（> 1 2 h)，高壓蒸氣滅菌。這可使得存在于水中的RNase 失活，處理過的水用于本節中溶液的配制和溶解 RNA 樣品。

（2）TRIzo〖試 劑（Invitrogen)。

（3）氣 仿（Fisher Scientific)。

（4）異 丙 醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇，加 30 mL DEPC 處理的水至 70 mL 無水乙醇中。

（6）Oligo (dT) 纖 維 素（New England BioLabs， NEB)。干燥的 Oligo (dT) 纖維素與 0 ?I mol/L NaOH 混合使其成漿狀，填充入一個無菌的柱子或 I mL 滅菌棉花或者玻璃絲塞住的注射器。在加樣前先用上樣緩沖液平衡柱子。

（7）上樣緩沖液： lm ol/LNaCl， 2 mmol/L 磷酸緩沖液， PH7.2。

（8）洗漆緩沖液（middle wash buffer) : 上樣緩沖液+0.3 mol,+LNaCl。

（9）洗脫緩沖液（elution buffer): 10 mmol/L Tris——HCl， pH7. 2?7. 4 ， I mmol/LEDTA

（10）3 mol/L 乙酸鈉， pH 5. 2。

（11）乙醇。

2 cDNA 文庫的構建

3 CDNA 文庫的擴增

（1）NZY 平 板（24 cmX24 cm )， LB-氛卞青霉素肉湯， XLl-Blue 菌種 ， NZY 瓊脂，NZY 上 層 瓊 脂（見 2 中 第 19、 20 項）。

（2）TSM 緩 沖 液（見 2 中 第 16 項）。

（3）氯 仿（Fisher Scientific)。

（4）二 甲 亞 諷（DMSO; Sigma-Aldrich)。

4 cDNA 文庫差異表達的篩選

（1） NZY 平 板（24 cmX24 cm, 見 2 中第 19、 20 項）

（2）Hybond-14 0.45/1111 孔徑的尼龍膜（GE Healthcare)。

（3）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0. 3 mol/L 檸 檬 酸 鈉（I L 配方： 175 g NaCl， 88 g檸檬酸鈉）；用蒸餾水稀釋。

（4）變性緩沖液： I.5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。

（5）中和緩沖液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L Tris-HCl， pH 8. 0。

（6）沖洗緩沖液： 0.2mol/LTris-HCl， p H 8. 0, 2XSSC。

（7）Whatman 濾紙或層析紙（Fisher Scientific)。

（8）dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP 各 1 0 mmol/L)。

（9）固定的 Oligo (dT) 引物： 5’ - dT (15) A/G/C-3、 可 購 買 商 業 化 產 品（Invitrogen； New England Biolabs) 〇

（10）Nasin (20 U/μL, Promega)

（11）二 硫 蘇 糖 醇（DTT) (Sigma-Aldrich)，用無菌水配置成〇? I m ol/L 儲存液。

（12）A M V 反 轉 錄 酶（10 U/μL) 和 10X 反轉錄緩沖液（Promega)。

（13）[α^-32P] dCTP (3000 Ci/mol; GE Healthcare) 。

（14）RNaseA (60 mg/mL, Sigma-Aldrich)0

（15）快 速 離 心 柱（quick spin column) (TE; Sephadex 0 2 5 ， Fine)，用于放射性標記的 DNA 純 化（Roche)。

（16）IX T wEl 緩沖液： 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。

（17）雜交緩沖液，改良的 Church’s 緩沖液： 0.25 mol/L Na₂ HPO₄, 0.25 mol/LNaH₂ PO₄ (PH 7. 5)， lmmol/LED TA， 7 % 十二烷基磺酸鈉（SDS; W/V );或夠買商業化的緩沖液； Ultrahybe (Ambion)。

（18）洗膜緩沖液（membrane washing buffer): 0. 1XSSC， 0 ?1 % SDS (W/ V)。

（19）膜清洗緩沖液（membrane rinsing buffer): 0.1 X SSC。

（20）X 光 片（Koda)。

(21)TSM 緩沖液：（見 2 中第 16 項）。

(22)氯仿（Fisher Scientific)。

(23)XLl-Blue 培養基。

(24) N ZY 上 層 瓊 脂（見 2 中第 19、 20 項）。

5菌體內克隆的檢出

(1)XLl-Blue 菌種。

(2)10 mmol/L MgSO₄。

(3)ExAssist helper 嗤菌體。

(4)Uni-ZAP X R 噬菌體儲存液。

(5)LB- 氨芐青霉素肉湯（見 2 中第 18 項）。

(6)SOLR 細胞。

(7)L B 氨芐青霉素瓊脂平板： 15 g 瓊脂粉加至 L B 肉 湯 中（I L)，高壓蒸氣滅菌。冷卻至 50°C 以下鋪平板，加人氨芐西林（lOOpg/mL) , 用恰當厚度鋪板。

6 質粒的小量抽提

（1）LB-氨芐青霉素肉湯（見 2. 2 中第 18 項）。

（2）預裂解緩沖液： 5 0 mmol/L 葡萄糖， 2 5 mmol, LTris-HC1， p H 8. 0, lOmmol/LEDTA

（3）RNase A (見 4 中第 14 項）。

（4）堿裂解緩沖液：0. 2 mol/LNaOH， 1% S D S , 該溶液需用之前新鮮配制。

（5）中和緩沖液： 5 m olZL 乙酸鉀， 30% 乙酸， 50 mm 〇 r L 葡萄糖， 25 mmol/LTris-HCl， pH 8. 0， 10 mmol/L EDTA0

（6）異 丙 醇（FisherScientific)

7.70% 乙 醇（見 2. 1 中第 5 項）。

7 插入序列的分離

（1）限制性內切酶： E co R I 和 Xho I (N ew EnglandBiolabs); 可根據接頭調節。

（2）IOX 限制性內切酶緩沖液，使用限制酶所附帶的緩沖液。

（3）DNA 上樣緩沖液：0. 25% (W /V ) 二甲苯氰， 0. 25% (W / V ) 溴酚藍， 50% 甘油。

（4）1% T A E 瓊脂膠和 50X T A E 緩 沖 液（見 2. 2 中第 11、 12 項

（5）DNA 分子質量標準（Invitrogen)，由表達克隆片段的大小而定（從 100 bp 到幾kb)。

（6）帶濾芯的移液器吸頭（Im L )。

（7）滅菌棉花或玻璃絲。

8 標記探針的合成

9 Northern 印跡

（1）10X MOPS 緩沖液： 200 mmol/L MOPS， 50 mmol/L 乙酸納， 10 mmol/L EDT A , pH 7. 0。

（2）I. 25% 甲醛變性膠：將 3.75 g 瓊脂糖溶于 217 m L 雙蒸水中，加 E B 至終濃度 Iμg / m L , 將該溶液 放 置 于 60°C 培養箱中。另取一滅菌瓶，加 人 30 mL IOX MOPS 緩沖液， 53 mL (37% , W ) 甲醛，將該溶液放人 60°C 培養箱中。等到兩種溶液都平衡至 6 〇°C 后，將它們混合，輕輕旋轉混勻，注意不要產生氣泡，倒入較大的制膠板中。

（3）RNA 樣品溶解緩沖液： IXMOPS 緩沖液， 2.2 mol/L 甲醛， 5 0 % 甲 酰 氨（V/V )。

（4）6X R N A 上 樣緩沖液 ： I X MOPS 緩沖液， 5 0 % 甲 酰 氨（V/V )， 4 0 % 甘油(V/V )，加入幾滴溴酸藍和二甲苯氰作為示蹤染料。

（5）HybondO.45 pm 孔徑的尼龍膜（GE Healthcare)。

（6）20XSSC (見 4 中第 3 項），必要時用蒸餾水稀釋至所需濃度。

（7）Whatman 濾紙或層析紙（Fisher Scientific)。

（8）紙巾。

（9）測序膠板。

（10）壓重物。

（11）玻璃或塑料吸管（5 或 IOmL) , 用來驅除轉膜裝置中的氣泡。

（12）塑料薄膜。

（13）Northern 印跡法的固定液： 0 ?05 mol/L NaOH。

1 0 用探針檢測 Northern 印跡

（1）雜交液： Ultrahybe 雜交緩沖液或者改良的 Church』 s 緩 沖 液（見 4 中 第 17項)。

（2）放射性標記的探針（見 2. 8)。

（3）Northern 雜交洗液：用蒸餾水配置 0. 1XSSC， 0.1% SDS。

（4）X 光片。

（5）Northern 印跡洗脫液：煮沸含有 0.5% SDS 的雙蒸水，將印記膜放入，用蓋革計數器檢測直至放射信號低于背景水平。

二、方法

已有針對特定的實驗（基因的高或低拷貝等）而設計的商業化產品來檢測和鑒定差異表達的基因。盡管技術的發展日新月異，但從感興趣的組織/器官/有機體中分離mRNA 構 建 cDNA 文庫仍然是鑒定新基因和蛋白質的標準方法。有很多成熟的試劑和產品可供選擇來構建一個文庫；本章介紹了一種通用的標準方法用于構建文庫，篩選陽性克隆并對其分析。這些實驗方法使用了 Uni-Zap-cDNA 合 成 試 劑 盒（Stmtagene)(5)，但也可以修改后用于其他載體。一些通用的噬菌體克隆載體包括 plTriplEX(Clontech)、 pSPORTl (Invitrgen) 和 ISCREEN-1 (Novagen) , 但不局限于這幾種。文庫構建之后，用表達差異篩選來鑒定在測試條件下受誘導或抑制的基因克隆。這 里 我 們 以 新 基 因 的 鑒 定 為 例 說 明 具 體 的 實 驗 步 驟 ，該基因在海蝸牛的肝胰腺組織中表達，并在缺氧條件下被誘導。這種表達上調被 Northern 印跡所證實。似印-2克隆的序列測定后，進一步的序列分析參見 3. 11。

1 總 RNA 的提取分離

（1）現今有許多試劑盒可用于總 RN A 和 mRNA 的 分 離（Ambion、 Roche、 Qiagen、Invitrogen、 Novagen 等）。這些試劑盒可獲得高純度和高質量的 RNA， 但相對來說價格較貴。這里我們介紹了傳統常規的 RN A 抽提方法。

（2）每 100 mg 組織加入 Im L TRIz0I 勻漿，并加入 0.2 m L’ m L 氯仿。顛倒混勻 15s，室溫放置 2?3 min。 4： ° C ， 12 000 g■離心 15 min。

（3）轉移上層水相至一新的 Eppendorf 管，加入等體積的異丙醇沉淀 RNA。在室溫放置 10 min。

（4）4°C ，最高轉速離心 10 min。移去上清，用 250 pL 7 0 % 乙醇洗滌沉淀，最高轉速離心 5 min。吸去乙醇，在室溫空氣干燥 RNA 10 min, 用適量的 DEPC 處理的 水 溶 解（假 定 10 mg 組織獲得的 RNA 量 為 IOfXg)。 儲 存 于 4°C (一周之內）或者一 20°C (長期保存)。

（5）用紫外分光光度計測定 260 nm 和 280 mn 光吸收值，用以確定 RN A 濃度和純度。 A260/A 280 為 1. 6?2. 0 為可接受的范圍（見注釋 1)。

（6）用結合有 Oligo (dT) 的纖維素柱子純化 poly (A )+ InRNA。總 R N A 加熱至65°C ，與上樣緩沖液 1 : 1 混 合（V/V )，上樣至 Olig0 (dT) 的纖維素柱。

（7）用一個柱床體積的上樣緩沖液沖洗柱子，收集洗脫液于無菌 Eppendorf 管。將洗脫液再上樣、收集，重復兩次。

（8）分別用一個柱床體積的上樣緩沖液和洗滌緩沖液沖洗柱子，最 后 用 1.5 倍柱床體積的洗脫液洗脫。最后一步使 poly (A )+ InRNA 得以洗脫，加入0.1 倍體積的 3 mOl/L 乙 酸 鈉（p H 5?2)， 2?5 倍體積的無水乙醇，放置于一 20。 C 沉淀過夜。操作程序可在此停止。

（9）第二天于 4°C , 13 000 g 離心 45 min。棄上清用 7 0 % 乙醇洗 滌（250 fxL), 以相同速度離心 10 min。所獲得的沉淀為 mRNA, 空氣干燥并溶于 DEPC 處理的水中（見注釋 2)。如果不立即用 mRNA 進行實驗，則將樣品儲存于一 8 〇°C 。

2 cDNA 文庫的合成

3 滴度測定和 cDNA 文庫擴增

4 cDNA 文庫的差異篩選

5 體內克隆的撿出

6 質粒的小量抽提

7 插入片段的分離提取

8 標記探針的合成

9 Northern 印跡

10用探針進行 Northern 印跡

11 克隆分析

具有差異表達的克隆應該用標準方法雙向測序（不管在實驗室還是在 DNA/基因組測序機構）。隨后的序列分析可用商業化的軟件和其他大量的在線分析工具進行。下面列出了一些優秀的進行 cDNA 和氨基酸序列分析的生物信息學軟件和應用工具。
第一步， DNA 序列應被拷貝至 NCBI 的 BLAST 服務器比對已有的和注釋過的序列 。相同的基因序列或與表達序列標簽（expressed sequence t a g ) 的相似性可由 E 值決定 。 E 值表示每一對序列相似的可能性。當 E 值 ^{-5 意 味 著 該 序 列 比 對 不 是 由 錯 誤 產
生的。新的或未知的基因通常無法得到配對，但一些保守區域可得到鑒定并提供很短的序列配對。}

(1)國 立 生 物 技 術 信 息 中 心（NCBI)

http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/

1.Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)： http：/ /blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast

BLAST 首先給出了在一個序列中四個字母所表示的殘基，然后由這些字母所擴展組成的片段。所使用的程序中， Wastx 用于將查詢的核苷酸序列的所有可讀框翻譯成蛋白質序列后與蛋白質數據庫中的數據比對。 tblastx 是將查詢的核苷酸序列翻譯后與核苷酸序列數據庫翻譯結果比對。 blastp 是將查詢的氨基酸序列與蛋白質數據庫對比。
2.ORF (可讀框）finder: http://ncbi.nlm. nih. gov/gorf/gorf.htmlORFfinder 可鑒定一個核苷酸序列中所有 6 種可讀框的編碼區域。選擇好的可讀框可以直接轉入 BLAST 進行保守區域或相似序列的搜索（blastp)。

（2） 基 因 的 翻 譯 和 蛋 白 質 序 列 的 鑒 定

新基因功能的鑒定是當前許多大規模的基因組計劃面臨的挑戰。 mRNA 序列包含許多信息，但常規來說蛋白質才是功能執行者。為了預測某一特定基因的功能，常常將基因序列翻譯成預測的蛋白質序列來分析與已知功能蛋白的同源性和保守區域。許多情況 下 ，一 個 cDNA 克隆通常代表了一個已知的同源物。這些克隆所代表的基因或蛋白質通常可與現有的功能模式相匹 E ，因為這些基因很可能已在其他系統、器官、組織(在各類應激和環境條件下）中被鑒定出，并具有已知的作用和功能。然 而 ，如果目的克隆沒有任何已知的同源物，則需進行進一步的分析和鑒定。一些用于分析新基因或蛋白質的軟件如下：

PredictProtein (蛋白質預測）：

http：//www.embl-heidelberg.de/predictprotein<，predictprotein. html

將被翻譯的目的蛋白質序列用 PredictProtein 服務器搜索，得到的結果是數據庫中的相似序列和蛋白質結構的預測。

蛋 白 質 序 列 分 析（Protein Sequence Analysis， PSA) :

http:// bmerc-www.bu.edu/psa/request.htmPSA 根據氨基酸序列預測蛋白質的二級和四級結構。

SOSUI：

http ：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosui_ submit,html

該工具軟件通過所輸人的氨基酸序列的理化性狀（如疏水性和電荷），預測膜蛋白的二級結構。

PROSITE：

http：//www.expasy.ch/prosite

PROSITE 是一個蛋白質保守域數據庫。基于蛋白質的基本序列，查詢得到的結果是與具有生物學意義的結構模式的匹配。

PSORT：

http ：// psort.nibb.ac.jp/

在基因被翻譯成蛋白質后，氨基酸序列通常都包含了轉位和定位信號的區域。這一信號決定了蛋白質在細胞內的定位并可幫助確定其功能。 PSORT 將輸入序列與分選信號同義序列比較確定是否存在信號分選序列。

SignalP ：

http：//www.dtu.dk/services/SignalP

ag n alP 程序用于預測在所輸入的氨基酸序列中信號肽斷裂位點存在與否。

Submitting DNA sequence to NCBI GenBank：

http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/submit,html

在所研究和鑒定的 DNA 序列發表之前，必須將該序列注釋后提交到序列數據庫。提交的信息需包含如編碼區、起始密碼子和終止密碼子或者其他相關信息。用互聯網瀏覽器，新的序列通過 Bank It (基于互聯網的工具）或 Sequin (獨立的提交工具軟件)提 交 至 GenBank。