| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
CsCl ( 固體）（用于三級不連續梯度的 CsCl 液層），溴化乙錠（10 mg/ml )，TE ( pH 8.0)。
2. 核酸和寡核苷酸
粗制質粒樣品
每個梯度的 DNA 用量宜來自不超過 50 ml 過夜培養物的粗制質粒。來自 100 ml 培養物的粗制質粒樣品則應重溶于約 0.9 ml TE（pH 8.0）中，從而在兩個不連續梯度之間足以形成一個中間層。
3. 專用設備
皮下注射針頭（21 號），折光儀（可選），帶有 18 號骨髓針頭（10 cm）的注射器（3 ml、5 ml 和 5~10 ml），帶有 18 號骨髓針頭（10 cm）的結核菌素注射器（1 ml）。
4. 離心機和轉子
超速離心轉子和離心管
帶有 5 ml 或 10 ml polyallomer 超速離心管的 Beckman 型 70.1 Ti 或 Sovall 型 65.13 轉子（Beckman Quich-Seal 或相當產品）。
二、方法
1. 用一個帶有 18 號骨髓針頭（10 cm ) 的 3 ml 皮下注射器，轉移 1.5 ml 頂層 CsCl 溶液 ( 35%) 至一個 5 ml polyallomer 超速離心管（Beckman Quich-Seal 或相當產品）中。
2. 用一個帶有 18 號骨髄針頭（10 cm ) 的 1 ml 結核菌素注射器，將 0.5 ml 含有質粒 DNA 的中層 CsCI 溶液（44% ) 鋪于頂層液下方的離心管底部。
3. 用一個帶有 18 號骨髓針頭（10 cm ) 的 5 ml 皮下注射器，將底層 CsCl 溶液（59% ) 鋪于中層 CsCl 溶液下方、充滿離心管。
4. 將該密封的離心管以 330000 g ( 60000 r/min, Beckman 型 70.1 Ti 轉子）離心 5 h。離心時確保轉子中離心管重量的平衡。按照廠家說明密封離心管。
使用更高速的離心機和轉子能夠進一步減少離心時間。例如，使用 Beckman Xl-90 的 Vti90 轉子，只需離心 20 min。
5. 收集閉環 DNA 區帶：
(1) 用 21 號皮下注射針頭在離心管頂端扎一個小孔以使液體被吸出時空氣能進入。
(2) 用乙醇小心擦拭離心管外壁以除去任何油脂，然后用一塊 Scotch 膠帶或 Time 膠帶貼于管外壁。
膠帶起密封作用以減少針頭穿刺后的泄漏。
(3) 將一個 5~10 ml 的一次性注射器裝上一個無菌的 18 號皮下注射針頭，將針頭斜面向上地穿過膠帶插入管中，以使針頭的斜面開口正好位于較低的 DNA 區帶 ( 閉環質粒 DNA ) 的下方。
(4) 緩慢吸出質粒 DNA，小心不要攪動上方黏稠的染色體 DNA 區帶。
欲避免染色體 DNA 的污染，不要試圖從梯帶中移去毎一點可見的痕量閉環質粒 DNA。
有些研究者喜歡在移去較低的閉環質粒 DNA 區帶之前先去除較上方的 DNA 區帶。此法不太可取，這是因為位于較上層的黏稠的高分子質量染色體 DNA 能纏繞住閉環質粒 DNA 并將其帶出離心管。
6. 從 DNA 中去除溴化乙錠。 |
|---|
