熱穩定 DNA 聚合酶除了在 PCR 反應中應用外，還可用來替代測序酶或 Klenow 片段進行雙脫氧鏈終止法測序。它在高溫下（70°C) 進行等溫鏈終止反應的能力可減少測序反應中由于模板 DNA 上引物假結合位點與引物退火錯配產生的問題，它還可用于富含二級結構模板的測序。本實驗源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 試劑、試劑盒 | 去離子蒸餾水ddNTPdNTP甲酰胺加樣緩沖液。酶和緩沖液。Taq 酶或類似的熱穩定 DNA 聚合酶Taq 酶稀釋緩沖液核酸和寡核苷酸寡核苷酸引物模板 DNA(100ug ul) 溶于 TE 中放射性化合物5'32P 標記的寡核苷酸引物 |
|---|
| 儀器、耗材 | 微量離心管（0.5 ml) 或微量滴定板裝有多孔加熱板的程控熱循環儀可加熱到 65°C 的水浴 |
|---|
| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
試劑、緩沖液、儲液的組成參見附錄 1, 儲液使用前稀釋到適當濃度。
去離子蒸餾水（冰預冷）
ddNTP,4 種 ddNTP 儲液（5 mmoI/L)
dNTP,4 種 dNTP 儲液（lmmol/L)
甲酰胺加樣緩沖液
10x 標記混合液和 ddNTP 延伸/終止混合液
當測序模板富含二級結構時，用等摩爾 7-脫氨-2'-dGTP 代替 10X 標記混合液和 ddNTP 延伸/終止混合液中的 dGTP。
酶和緩沖液
5x 反應緩沖液
200 mmol/LTris-Cl(pH8.8)
25 mmol/LMgCl2
Taq 酶（5u/ul）或類似的熱穩定 DNA 聚合酶
Taq 酶稀釋緩沖液
25 mmol/LTris(pH8.8)
0.01 mmol/LEDTA(pH8.0)
0.15%Tween-20
0.15%NP-40
從其他生物體提取的熱穩定酶的反應條件和反應緩沖液可能稍有不同。不同酶的最適緩沖液條件見制造商提供的使用說明書，單位熱穩定 DMA 聚合酶的活性通常定義為：在 70~80°C，反應 30 min 將 10nmol 核苷酸轉化為酸沉淀形式所需酶量為 1 個酶活性單位。
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
濃度為 1.0pmol/pl(約 6.6ng/ul), 溶于 TE(pH7.6) 中。
對于一些結合于靶區域上游載體序列的通用引物，可參見第 8 章信息欄“通用引物”及本章末尾信息欄“DNA 測序寡核苷酸引物儲液制備”。
模板 DNA(100ug/ul) 溶于 TE(pH7.6) 中
每一套測序反應需要 500ng 的單鏈 DNA 或 1.0ug 的變性雙鏈質粒 DNA。變性雙鏈線性 DNA, 并使它與引物復性。即先把天然模板 DNA 與過量的引物混合，在沸水浴中加熱約 2 min, 然后把試管插入冰水浴中。不要讓混合液溫度回升，立刻使用。
小規模制備 M13 噬菌體重組于單鏈 DMA 的濃度一般在 0.05 到 0.5ug/ml 的范圍內。這取決于特定噬菌體的生長速度。在正常的 Taq 酶催化的測序反應情況下，棋板 DMA 是過量的。因而每次測序反應中模板量上的微小變化并不影響測序結果的質量。可參見方案 4 的疑難解答。
放射性化合物
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-35S]dATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-33P]dATF(2000—4000Ci/mmol，~10mCi/ml) 或
5'32P 標記的寡核苷酸引物
若不用放射性標記 dATP 作為內標記，也可以用 5‘端以 32P 或 33P 標記的寡核苷酸引物進行測序反應。此時，可用 1.0~1.5pmol 放射性標記引物和 2ul 水代替反應中未標記引物和放射性標記 dATP(步驟 1), 其他步驟相同。一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 轉移至寡核苷酸 5’末端。詳細情況見第 10 章的方案 2。
專用設備
微量離心管（0.5 ml) 或微量滴定板（柔韌，耐熱，每孔容量為 300ul 的 U 型孔 96 孔板）。
參見信息欄“微量滴定板”
裝有多孔加熱板的程控熱循環儀（如 Dri-Blockcyclers,Techne 公司）。
其次可選用 45°C 和 72°C 的水浴。見第 8 步的說明，
可加熱到 65°C 的水浴。
方法
1. 在 0.5 ml 微量離心管或微量滴定板孔中加入:
單鏈模板 DNA(250fmd)(100ng/ul) 5.0ul
寡核苷酸引物（0.5pmol)(約 3.3ng/ul) 3.0ul
5x 反應緩沖液 20.ul
2. 在 65°C 溫育密封的微量離心管 2 min。從水浴中取出離心管，使之在 3~5 min 內冷卻到室溫。
有些實驗人員喜歡用小加熱板或裝水的燒杯，使該退火反應在 30 min 的過程中緩慢卻。我們實驗中發現，這兩種方法的實驗結果相同。
3. 在引物和模板降溫時，融化 10X 標記混合液、ddNTP 延伸/終止混合液和放射性標記的 dATP, 融化后置于冰上。
4. 在每一彩色標記的 0.5 ml 微量離心管或每一個提前標有 C、T、A 和 G 的微量滴定板孔中加入 4ul 與其相對應的 ddNTP 延伸/終止混合液（如標記為 C 的微量離心管和微量滴定板孔加入 4ul ddCTP 混合液，標記為 T 的微量離心管和微量滴定板孔加入 4ul ddTTP 混合等），并將微量離心管或微量滴定板置于冰上。
5. 按 1:8 比例稀釋足夠的熱穩定 DNA 聚合酶用于所有模板測序，例如：
TaqDNA 聚合酶（5~101u/ul)
酶稀釋緩沖液 7ul
每一組四種測序反應需要 2ul(2u) 稀釋酶。酶終濃度應約為 lu/ul。稀釋后的酶要一直放在冰上貯存。
6. 把下列物質加入到備退火反應管中（上述步驟 2):
10x 標記混合液 2ul
放射性標記 dATP 0.5ul
稀釋的 DNA 聚合酶（約 1u/ul) 8ul
渦旋振蕩混勻，然后在 45°C 溫育反應 5 min。
7. 轉移 4ul 標記反應液到含有相應的雙脫氧終止混合液的 C、T、A、G 各管或微量滴定板各孔中（上述步驟 4), 沿微量離心管和微量滴定板孔壁加入。
8. 把小離心管放入微量離心機內（用合適的轉頭或適合 0.5 ml 離心管的銜接頭，或把它們放入去蓋的 1.5 ml 離心管中），或者把微量滴定板放入配有合適銜接頭的離心機中，以 2000r/min 離心 C、T、A 和 G 各管或滴定板幾秒鐘，混合反應物。72°C 溫育 5 min。
把小離心管或滴定板放在高效加熱塊中溫育，也可以放在水、油或其他導熱效率高的介質中。若放在 72°C 空氣溫箱中，在這樣短的溫育過程中達不到 TaqDNA 聚合酶所需的理想溫度，
9. 加入 4ul 甲酰胺加樣緩沖液終止反應。
10. 這些反應物在-20°C 時最多可保存 5 天，也可以用變性凝膠電泳直接分析（見方案 8、9 或 10、11 和 12)。熱變性后（100°C,2 min)，在冰上快速冷卻。取 C、T、A 和 G 反應物各 3ul 加入測序凝膠的各孔中。 |
|---|
