大量細菌克隆的雜交方法篩選實驗

重組質粒轉化的 E.coli

LB 或 SOB 瓊脂板平頭鑷子18 號針頭硝酸纖維素膜注射器Whatman 3 MM 圓形濾紙

一、材料

1. 培養基

(1) 含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板。

本方案中使用 2~3 天舊板效果最好，因為舊板更容易吸收接種物中的水分。

(2) 含有適當抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 瓊脂板。

(3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 瓊脂板。

氯霉素貯存液濃度應為 170~200 μg/ml。

2. 專用設備

平頭鑷子（如 Millipore 鑷子）

18 號針頭

硝酸纖維素膜（Millipore HATF，或相當產品）或尼龍膜，無菌無去污劑污染

注射器（3 cc）

Whatman 3 MM 圓形濾紙。（提前準備一疊 Whatman 3 MM 濾紙（毎一硝酸纖維素或尼龍膜各準備一疊，還要加一些備用品），并裁減成比濾膜稍大一點。一些廠家已有預制好的圓形濾紙出售。用鉛箔包好濾紙，高溫高壓消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm²) 10 min ]。

3. 載體和菌種

重組質粒轉化的 E.coli，用作培養物。

或

擴增的 cDNA 文庫，生長為培養物。

二、方法

1. 用軟鉛鉛筆或圓珠筆在干濾膜上作好標記，用水浸濕后將濕濾膜夾在干的 3 MM 濾紙之間，用鋁箔松散地包好，液相循環高溫高壓消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm²) 10 min]。

準備足夠的濾膜用來從起始板制備 1 或 2 張備份。備份最好用消毒的無菌濾膜，但如果不再從主板制備備份，未消毒的濾膜也可以用。

2. 用平頭鑷子將一張消過毒的濾膜，標記面向下，置于含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板已制備 2~3 天，濾膜完全浸濕后，將其從板上揭下，翻過來標記面向上，再置于瓊脂板表面。

3. 將小體積的菌液置于瓊脂板表面的濾膜中心，用一個無菌玻璃棒使菌液分散，在濾膜四周留出 2~3 mm 寬的無菌區。

大濾膜（直徑 137 mm）可提供 0.5 ml 細菌懸液，含 2X10⁴ 個活菌；小濾膜（直徑 82 mm) 提供 0.2 ml 細菌懸液，含 ~10⁴ 個活菌。

4. 將瓊脂板的蓋半開（不要倒置）置于通風櫥內數分鐘使接種物中的水分蒸發，蓋上蓋子，顛倒瓊脂板于 37℃ 培養直至出現直徑 0.1~0.2 mm 的小菌落（約 8~10 h)。

5. 如需要，可在此時按步驟 6 制備備份濾膜，否則按以下步驟使菌落可凍存于 -20℃：

(1) 將濾膜菌落面向上轉移至含有適當抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 瓊脂板表面。

(2) 于 37℃ 培養 2 h。

如進行 cDNA 文庫篩選，最好將主板冰凍。冰凍可減少真菌污染使主板保存數月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主濾膜可在 4℃ 保存 2 周。

(3) 用 Parafilm 膜封好瓊脂板，顛倒置于封閉的塑料袋的于 -20℃ 保存。

于室溫使主板（仍以顛倒位置 ) 解凍后即可制作備份。

6. 將主膜（硝酸纖維膜或尼龍膜）菌落面上置于無菌的 Whatman 3 MM 濾紙上。

7. 標記一張濕的硝酸纖維膜或尼龍膜，置于主膜上，防治在兩膜之間形成氣泡。

最好將第二張濾膜稍微卷曲，以使兩張濾膜首先在中部接觸。兩膜一旦接觸，就不要相互移動。盡量使兩張濾膜不要完全重疊，以便于以后使兩者分離。

8. 在濾膜上再蓋一張圓形 3 MM 濾紙，并在濾紙上放一個培養皿，用手掌向下緊壓培養皿以使細菌從主膜轉到濾膜上。

9. 拿掉培養皿和頂層 3 MM 濾紙，用連接注射器的 18 號針頭在雙層濾膜作一些空，以作標記方位。

確保針頭剌穿兩層濾膜。

10. 使兩膜分開，將備份膜置于新鮮的含有適當抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 瓊脂板。

此時，可按步制備第二張備份，用主膜上已有的孔標記第二張備份膜。

11. 將另一張備份膜和主膜置于新鮮的含有適當抗菌素的 LB ( 或 SOB) 瓊脂板，于 37℃ 培養，直到長出菌落（4~6 h)。

12. 這一階段，當細菌生長依然很快，濾膜可以轉到含有氯霉素的（170~200 μg/ml) 的（或 SOB ) 瓊脂板，于 37℃ 培養 12 h。

13. 將主膜轉到新鮮的含有適當抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 瓊脂板，而后按步驟 5 凍存。

14. 裂解附著于備份膜上菌落，將釋放出的 DNA 固定于硝酸纖維膜或尼龍膜。進行雜交。