本節介紹一種利用結合細菌蛋白質的基質去除粗制免疫球蛋白中與細菌編碼蛋白質發生反應成分的方法（de Wet et al.1984)。該方法也適用于利用培養的細胞或組織抽提物去除交叉反應抗體。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 試劑、試劑盒 | 緩沖液和溶液細胞裂解緩沖液NaOHTris-緩沖鹽溶液TBSTriton X-100溶菌酶胰 DNA 酶 I制備用于文庫篩選的抗體大腸桿菌培養液 |
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| 儀器、耗材 | 離心和轉子親和層析柱溴化氫活化的 Sepharose 4B |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的組分請見附錄 12
將貯存液稀釋到適當的濃度。
細胞裂解緩沖液
0.1mol/L 醋酸鈉
1mol/L NaCl
用 0.45um 濾膜過濾細胞裂解緩沖液，室溫貯存。每 1L 培養細菌需要大約 100 ml 細胞裂解緩沖液。
NaOH(1mol/L)
Tris-緩沖鹽溶液（TBS) 和含 0.2%(m/V) 疊氮化鈉的 TBS
Triton X-100
酶和緩沖液
溶菌酶
使用分子生物學級的溶菌酶。加入固體洧菌酶以輔助裂解細菌。
胰 DNA 酶 I
在細胞裂解液中加入固體 DNA 酶 I 消化染色體 DNA。
抗體
制備用于文庫篩選的抗體
利用蛋白 A-Sepharose 親和層析制備的 IgG 片段，本方案可獲得最佳效果。用蛋白 Aipharoae 介質的親和層析法，請見 Harlow 和 Lane 法（1999)。
培養基
培養液
需要 1 升合適的大腸桿菌培養液。
離心和轉子
Sorval GSA 轉子或相當轉子
Sorval SS-34 轉子或相當轉子
專用設備
親和層析柱
5 ml 塞有玻璃棉的塑料注射器或 Bi-Rad Poly-Prep 柱子均適用。
溴化氫活化的 Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech) 或 Affi-GellO(Bia Rad)
載體和菌株
大腸桿菌作為制備表達文庫的宿主菌
方法
1. 將適當菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培養物培養至靜止期。
2. 用 Sorvall GSA 轉頭（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 離心 20 min 收獲菌體。
3. 棄去培養基，倒置離心管排出殘留培養液。
4. 將沉淀物重懸于 100 ml 的細胞裂解緩沖液中。
5. 加入 200 mg 溶菌酶，于室溫溫育菌液 20 min。
6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。
7. 于 4°C 溫育菌液 1 h, 或溫育至上清由混濁變清亮且黏度降低。
8. 將細菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 轉頭）離心 20 min, 小心將上清液倒入另一個燒杯內。
9. 用 1mol/LNaOH 將上清液 pH 調至 9.0。
10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法檢測裂解液中蛋白的濃度。
11. 將提取液驟冷至 0°C, 并按操作說明將菌體蛋白質結合于溴化氫活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。
12. 使用前，用含 0.2%(m/V) 疊氮化鈉的 TBS 平衡與大腸桿菌提取物結合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 樹脂。
13. 每通過親和層析純化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定體積的與大腸桿菌抗原相偶聯的樹脂。IgG 和偶聯的樹脂混勻后，在轉鼓中于室溫溫育 12~18 h。
14. 將勻漿液裝到親和層析柱上。用 TBS 洗脫抗體。收集洗脫液（每管 0.2 柱床體積）至OD280 降為 0。合并各管抗體，并將親和純化抗體貯存于-20°C, 以備免疫篩選時用。 |
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