桿狀病毒儲液制備實驗——從懸浮培養中制備

懸浮培養的 Sf 9 細胞待接種的桿狀病毒（野生型的或重組）

含10％胎牛血清的昆蟲細胞培養液 TNM-FH

150 mm 培養瓶27℃ 培養箱倒置顯微鏡帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃GPR離心機帶螺口蓋的凍存管液氮罐500 ml 旋轉細胞培養瓶多轉瓶的攬拌臺

1. 用 50 ml TNM-FH /10％ FBS 培養液在 500 ml 旋轉培養瓶中培養 Sf 9 細胞，直到細胞密度達到約 1 × 10⁵ 細胞/ml（見昆蟲細胞保存培養實驗）。

2. 室溫下以 1000 g 離心 10 min 回收細胞，棄去上清。加入 10～20 ml 新鮮的 TNM- FH/10％ FBS 培養液重懸細胞團塊。加入感染復數（MOI）為 0.1～0.5 的病毒接種（見步驟 1.2）。

MOI 以 pfu/細胞來表示。感染給定數目細胞的病毒接種物的體積=MOI （pfu/細胞）× [細胞數/毒種儲液的滴度（pfu/ml）]

3. 將細胞重新放入旋轉培養瓶中，用 TNM-FH/10％ FBS 培養液將體積加至 100 ml。27℃ 置攪拌臺上以 60～80 r/min 恒速攪動，培養 3～4 天。周期性地取少量懸浮培養細胞在顯微鏡下觀察細胞病變效應及包含體。

4. 當大多數細胞含有包含體或顯示出細胞病變效應時（通常是感染 4～5 天后），將細胞培養液移入滅菌試管中，4℃ 以 1000 g 離心 10 min， 將上清移至一新的滅菌試管。分別吸取 1 ml 上清移至幾個螺口凍存管中，置液氮罐長期保存。將剩余的病毒置暗處 4℃ 短期保存。

病毒儲液也可以由懸浮生長的昆蟲細胞（Sf 9、Sf 21 和 HighFive）制備：用無血清或無蛋白質的昆蟲培養基來培養昆蟲細胞，在 100 ml 或 500 ml (只加至 250 ml）的旋轉培養瓶中，直到細胞密度達到（1～2）×10⁶ 細胞/ml。病毒應以 0.1～0.5 的感染復數直接加到懸浮培養液中，培養細胞 4～5 天，按步驟 2.4 收獲病毒。