RNA 標準轉錄體系的一般回收率為 lugRNA/ug 質粒 DNA, 使用下面的方法，可以提高回收率至 5?l0ug RNA/ug 質粒 DNA。大量制備 RNA 可以用于體外翻譯。
| 實驗材料 | 模板 DNA 或質粒 |
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| 試劑、試劑盒 | TETE 飽和酚氯仿異內醇3mol LNaAc無水乙醇5X 轉錄緩沖液lOOmmoL LDTTRNasinrATPrGTPrUTPrCTPSF6T3 或 T7RNA 聚合酶異戊醇DNase7.5mol L 乙酸銨無水乙醇乙醇 |
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| 實驗步驟 | 一材料與設備
1) 模板 DNA 或質粒
2)TE
3)TE 飽和酚：氯仿
4) 氯仿：異內醇 (24:1)
5)3mol/LNaAc(pH5.2)
6) 無水乙醇
7)5X 轉錄緩沖液：200 mmol/LTris-HCl(pH7.9),30 mmol/LMgCl2，10 mmol/L 亞精胺,50 mmol/LNaCl
8)lOOmmoL/LDTT
9)RNasin
10)rATP，rGTP,rUTP,rCTP，各 2.5 mmoI/L
11)SF6,T3 或 T7RNA 聚合酶
12)TE-飽和的酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1,PH4.5)
13)DNase
14)7.5mol/L 乙酸銨
15) 無水乙醇
16)70% 乙醇
二操作方法
1) 在室溫條件下按順序加入以下組分：
5X 轉錄緩沖液 2ul
DTT，100 mmol/L 10ul
RNasin100U
rATP,rGTPT,rCTP,rUTP(各 2.5 mmol/L) 20ul
線狀模板 DNA(1?2.5 mg/ml) 2ul
SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶 40U
加無 RNA 酶的水至終體積為 l00ul
2) 于 37?40℃ 反應 1 h
3) 按 RNA 標準轉錄反應所述的方法除去 DNA 模, 純化 RNA 轉錄物。 |
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