一、材料與設備
1. 合成的 DNA 寡核苷酸。
2. 靶基因 cDNA。
3. T7 RNA 體外轉錄試劑盒（Promega 公司）。
4. DNase Ⅰ 和單鏈特異性的 RNase。
5. 重組的 Dicer 酶。
6. 蛋白酶 K ( 0.2 mg/ml）。
7. 1X Dicer 反應緩沖液（250 mmol/L NaCl，30 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )， 0.05 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L MgCl2 )。
8. EDTA 10 mmol/L ( pH 8.0 )。
9. 水飽和酚。
10. 氯仿：異戊醇 ( 24 : 1 )。
11. 聚丙烯酰胺凝膠。
12. 電泳裝置。
二、操作方法
1. 將靶基因 cDNA 片段按正反兩個方向克隆到 T7 啟動子的下游，并采用 T7 RNA 體外轉錄試劑盒轉錄合成互補的兩條 RNA 鏈，兩條 RNA 鏈在體外互補形成雙鏈 RNA 分子，純化后備用（具體的操作方法見體外轉錄合成 siRNA 分子）。
2. 在 1X Dicer 反應緩沖液中加入約 500 ng 純化后的雙鏈 RNA 和適量的 r-Dicer，在 37℃ 反應適當的時間后（通過預實驗確定）加入 10 mmol/L EDTA 終止反應，經蛋白酶 K 處理后，采用酚：氯仿：異戊醇 ( 25 : 24 : 1 ) 抽提。如果是大量制備的話，其中的蛋白質與殘留的長 dsRNA 應該通過凝膠純化或通過柱層析純化。
3. 純化獲得的 siRNA 分子混合物可以直接用于轉染細胞，或置 -20°C 保存。siRNA 雙鏈復合物可以經過幾輪凍融而不受影響，不需要經過再次變性退火處理。但是在處理 siRNA 分子時，建議最好將 RNA 溶液置于冰浴中，以降低 RNA 水解的速率。
4. 為了確定獲得的 siRNA 分子的大小，可以通過 18% 變性聚丙烯酰胺凝膠 ( PAGE ) 進行分離并用合成的單鏈 RNA 分子作為對照；也可以通過 15% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行分離，分子量對照采用合成的雙鏈 siRNA 分子。 | 