RNA蛋白復合物中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保護實驗

蛋白酶 KAMV 反轉錄酶

緩沖液DNase ⅠDNase Ⅰ 緩沖液酚氯仿溶液乙酸鈉RNasinE.coli RNase HTBE 緩沖液過硫酸銨溶液尿素凝膠點樣緩沖液轉移緩沖液SSPE 緩沖液核苷酸溶液瓊脂糖丙烯酰胺RNP 凝膠點樣緩沖液

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳電轉移設備尼龍膜

一、材料與設備

所有的緩沖液和溶液必須無 RNA 酶污染。

1. RNP 制備和 DEAE 層析

(1) 緩沖液 D : 20 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA。20% 甘油，高壓滅菌。在使用前加 DTT 至 1 mmol/L。加苯甲磺酰氟（PMSF）至 0.1 mmol/L。

(2) DEAE-Sepharose CL-6B ( Pharmacia 公司、Piscaraway，NJ，USA )。

(3) 緩沖液 D₁₀₀ ：20 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl₂，20% 甘油，高壓滅菌。在使用前加 DTT 至 1 mmol/L，加苯平橫酰氟（PMSF ) 至 0.1 mmol/L。

(4) 緩沖液 D₁₀₀ : 同緩沖液 D₁₀₀，但是 KCl 濃度為 400 mmol/L。

2. RNA 制備

(1) 蛋白酶 K ( PK ) : 用 dH2O 配制成 10 mg/ml 儲存液，儲存在 -20°C。

(2) 2X PK 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，2% ( m/V ) SDS。

(3) 無 RNase 的 DNase Ⅰ( 10 U/μl，Boehringer Mannheim 公司，Indianapolis，IN，USA )。

(4) 10X DNase Ⅰ 緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5)，50 mmol/L MgCl₂。

(5) 酚：氯仿溶液：等體積酚和氯仿混合，先用 100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 ) 進行平衡，再用 TE [ 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 )，1 mmol/L EDTA ] 緩沖液平衡。

(6) 3 mol/L 乙酸鈉（pH 7.0 )，高壓滅菌。

3. 寡核苷酸靶向的 RNase H 保護試驗

(1) 與靶向 RNA 序列互補的 DNA 序列，長 12~20 nt。

(2) RNasin ( 40 U/μl，Promega 公司，Madison，WI，USA )。

(3) E.coli RNase H（1 U/μl，Bochringer Mannheim 公司）。

4. Northern 印跡和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(1) TBE 緩沖液：90 mmol/L 的 Tris-硼酸鹽，2 mmol/L EDTA。

(2) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺-尿素溶液：用 TBE 緩沖液制備含 0% 和 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺為 20：1 ) 的溶液，含 50% 尿素，過濾，室溫保存在棕色的瓶子中。

(3) 用 dH₂O 配制 10% 過硫酸銨溶液。

(4) N，N，N'，N'，四甲基乙二胺（TEMED）。

(5) 尿素凝膠點樣緩沖液：50% 尿素（m/V），1X TBE 緩沖液，0.05% 溴酚藍（m/V），0.05%（m/V）的二甲苯青。

(6) 轉移緩沖液：10 mmol/L Tris-乙酸鹽（pH 7.8)，5 mmol/L NaAc，0.5 mmol/L EDTA。

(7) 電轉移設備（Biorad 公司、Hercules、CA、USA )。

(8) 尼龍膜：采用不帶電荷（Amersham 公司，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK）或者帶正電荷的尼龍膜（Boehringer Mannheim 公司）能夠獲得好的結果。

(9) 3 MM 層析紙（Whatman 公司、Clifton、NJ、USA )。

(10) 20X SSPE 緩沖液：3.6 mol/L NaCl，200 mmol/L Na₂HPO₄（pH 7.7），2 mmol/L EDTA。

(11) Denhardt's 溶液（100X）：2% ( m/V）BSA 組分 V；2% （m/V）Ficoll 400；2%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮。

(12) 10% SDS (m/V) 儲存液。

(13) 預雜交溶液：5X SSPE 緩沖液，5X Denhardt's 溶液，0.1% SDS，50 μg/ml tRNA。

(14) ³²P 標記的寡核苷酸（1 ng/μl，1~5X10⁷ cpm/μg DNA），使用 T4 多核苷酸激酶和 [ λ-³²P ] ATP 標記 5' 末端。

5. 引物延伸

(1) AMV 反轉錄酶（5~10 U/μl，Promega 公司），包括 5X反應緩沖液。

(2) 含有 dATP、dCTP、dGTP、dTTP（濃度均為 10 mmol/L）的核苷酸溶液。

(3) ³²P 標記 DNA 寡核苷酸片段。

6. 自然狀態下 RNP 的凝膠電泳

(1) 瓊脂糖。

(2) 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺為 80：1）溶液。

(3) RNP 凝膠點樣緩沖液：0.3X TBE 緩沖液，80% 甘油，0.05% (m/V) 溴酚藍（m/V)，0.05% (m/V) 的二甲苯青。

(4) 1.5 mm 墊片和小的垂直板凝膠的梳子。

二、試驗方法

1. RNP 的制備

無論是全細胞、細胞質還是細胞核都可以制備 RNP。盡管 RNase H 切割試驗可以在粗提物中成功的進行，但是這些結果的準確性有待于進一步的驗證，因為相同的 RNA 可以存在于不同的 RNP 中或者以不同的構象存在，另外在粗提物中進行試驗，RNP 和 RNase H 切割產物的降解也是一個嚴重的問題。這些潛在問題可以通過 DEAE 層析純化 RNP 在一定程度上避免，DEAE 層析可以富集剪接體 snRNP，但是這樣的處理過程給 RNA-蛋白的相互作用增加了額外的條件，比如進行高鹽洗脫時許多 RNP 就被壓縮成結構緊密的穩定復合物，從而影響了對它們的分析。

DEAE 層析所有步驟必須在 4°C 進行。

(1) 制備一個 5 ml 的 DEAE-Sepharose 柱，用于經緩沖液 D 透析的 50 ml 粗提物的分級分離。先用水和乙醇洗柱子，再用少量的緩沖液 D₁₀₀ 洗層析柱，用 1:1 的 DEAE-Sepharose 的 D₁₀₀ 懸液裝柱，這步最好用蠕動泵進行，用 5 ml 緩沖液 D₁₀₀ 洗層析柱。

(2) 調節粗提物中 MgCl₂ 濃度至 10 mmol/L。將粗提物緩慢加入到層析柱中，注意不能讓層析柱流干，用 50 ml 緩沖液 D₁₀₀ 洗層析柱。

(3) 換成緩沖液 D₁₀₀ 洗脫 RNP，收集洗脫液 15 管，每管 1 ml。

(4) 通過分析組分中 snRNP 的峰來確定蛋白質峰（通常在組分 5 和 10 之間），收集合適部分，液氮進行冷凍，儲存于 -70℃。

2. RNA 的制備

要確定 RNase H 保護試驗中 RNA 的保護是否是由于蛋白或 RNA 構象阻止酶接近造成的，必須用相同離子強度下去除了蛋白后 RNA 的 RNase H 切割試驗作對照。進行抽提物反應和對照反應的 RNA 數量應該相等，下面步驟的量可以根據要求增加或者減少。

(1) 將 100 μl 抽提物或者 RNP 制備物與 100 μl 2X 蛋白酶 K 緩沖液（蛋白豐富的抽提物此時變得輕微渾濁）混合，加蛋白酶 K 至終濃度為 0.2 mg/ml，在 50°C 條件孵育反應液 1 h。

(2) 酚：氯仿抽提：加入等體積的酚：氯仿，振蕩 10 s，16000 g 離心 2 min，將上清轉移到新的離心管中，如果在兩液面間有白色蛋白層，重復抽提一次。

(3) 用 3 倍體積無水乙醇沉淀 RNA，70% 乙醇洗滌，干燥沉淀。

(4) 用 89 μl 水溶解沉淀，加 10 μl DNase Ⅰ緩沖液和 1 μl DNaseⅠ，37℃ 孵育 30 min。

(5) 用等體積酚：氯仿抽提，加 1/10 體積 3 mol/L NaAc（pH 7.0）和 3 倍體積的無水乙醇進行沉淀，用 70% 乙醇洗滌，干燥沉淀。

(6) 用 100 μl 水溶解 RNA 沉淀，儲存于 -20℃。

2. 寡核苷酸靶向的 RNase H 保護試驗

了解 RNA 的二級結構對選擇 DNA 寡核苷酸雜交鏈靶向序列很重要，靶向序列多位于單鏈區或者環狀區。盡管 4 個堿基對的退火寡核苷酸作為 RNase H 切割的底物已經足夠，但是高效特異配對通常需要不少于 12 個堿基對的寡核苷酸，因此最好對憑經驗得 到的針對 RNA 不同序列的 DNA 寡核苷酸序列進行比較和評價。引物延伸效率可以用來選擇或者檢測寡核苷酸對特異 RNA 的直接結合能力。

(1) 標準 RNase 保護試驗一般在 25 μl 體系中進行，體系中含有 15 μl 抽提物或者 RNP 制備物，40 mg/ml DNA 寡核苷酸，12 mmol/L HEPES（pH 8.0），60 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L DTT，20 U RNasin，1 U E.coli RNase H。對照采用相同量的相同來源的 RNA 在相同的離子條件下進行。反應液在 30℃ 孵育 60 min。

(2) RNA 片段的分析，加入 75 μl 重蒸水，100 μl 2X PK 緩沖液，4 μl 蛋白酶 K 終止反應，如前所述制備 RNA [ 2 “RNA 的制備” 中步驟 (1)~(5) ]。

(3) 如果進行 RNP 片段的分析，反應液可以直接用于下面的試驗。

4. RNase H 切割產物- RNA 片段的分析

在進行 RNase H 切割以后對 RNA 片段的分析可以用 Northern blot 或引物延伸法進行分析。

(1) Northern blot

在 RNA Northern blot 分析時，探針一般選擇 DNA 寡核苷酸的互補片段，它們可以特異的檢測到非常小的 RNA 片段，因此在下面的操作步驟中，特殊的雜交和洗滌條件是針對寡核苷酸探針設計的。

① 變性 PAGE 凝膠電泳：安裝小的垂直凝膠（17 cm X 18 cm）玻璃板，墊片厚度為 0.4 mm。

② 8% 凝膠的制備：將 10 ml 20% 丙烯酰胺/ 50% 尿素和 15 ml 0% 丙烯酰胺/ 50% 尿素儲存液混合，然后加入 200 μl 10% APS 和 20 μl TEMED，混勻，立即灌膠。聚合完成以后（最少需要 3 min），用 1X TBE 緩沖液在 800V 預電泳 30 min。

③ RNA 沉淀重新溶解在尿素點樣緩沖液中，上樣前樣品在 90°C 加熱 1 min，短暫離心收集所有反應管底部的樣品，取適量上樣，用 TBE 緩沖液于 800V 進行電泳，直到溴酚藍到達凝膠底部。

④ 電轉移將 RNA 從聚丙烯酰胺凝膠轉移到尼龍膜上，做一個夾層結構保證凝膠和尼龍膜能夠緊密接觸，將兩個海綿墊和三張 3 MM 濾紙在轉移緩沖液中浸泡，同時將凝膠和尼龍膜在轉移緩沖液中進行平衡，在一個夾持器中按如下順序放置各層，海綿墊、兩層 3 MM 的濾紙、凝膠、尼龍膜、第二層 3 MM 濾紙、海綿墊，在放置時各個層之間避免出現氣泡，放置好后安裝到電轉移裝置上，加入轉移緩沖液，在 4℃ 條件下，50V 轉移 2 h。

⑤ 打幵夾層，尼龍膜空氣干燥 10 min，用 UV 交聯儀（312 nm）進行 RNA 和膜的交聯，RNA 面朝向光源，用最大強度照射膜 10 min，然后在空氣中使膜完全干燥。

⑥ 用雜交液在 37℃ 進行預雜交，時間不少于 2 h，然后加入 200 ng ³²P 標記的寡核苷酸探針，37℃ 雜交過夜。

⑦ 用5X SSPE，0.1% SDS 溶液洗滌兩次，然后再用 2X SSPE，0.1% SDS 溶液洗滌兩次，每次洗滌要在 37℃ 洗滌 15 min。

⑧ 用塑料膜完全包裹濕的尼龍膜，置于暗盒中進行 X 射線片顯影。

(2) 引物延伸

① 反應：用 13.5 μl dH₂O 溶解 RNA 沉淀，加 4 μl 5X 反轉錄緩沖液和 1 μl ³²P 標記寡核苷酸探針（1 ng/μl），70℃ 孵育 5 min。然后在冰上孵育 5 min。

② 轉錄反應：在 18.5 μl 的退火反應液中加入 1 μl 10 mmol/L 的 dNTP，0.5 μl 反轉錄酶，42°C 孵育 45 min。

③ 加入 2 μl 3 mol/L 的 NaAc（pH 7.0）和 60 μl 無水乙醇沉淀核酸，干燥沉淀，用尿素點樣緩沖液溶解沉淀，變性 PAGE 電泳分離。

④ 干燥凝膠，X 射線片顯影。

5. RNase H 切割產物-RNP 片段的分析

如果發生了位點特異的切割，那么通過對經 RNase H 切割產生的 RNP 片段的分析可以了解結構域的結構，也就是蛋白的哪個部分與哪一個 RNP 亞結構域相結合。從不同的 RNP 和 RNA 中分離特定的 RNP 的試驗方法包括甘油梯度離心、CsCI 密度梯度離心、RNP 非變性凝膠電泳。RNP 中的 RNA 可以釆用上面介紹的 Northern blot 或引物延伸法進行檢測。下面給出的是非變性凝膠電泳分析的步驟。

(1) 安裝小的垂直凝膠玻璃板，用 1.5 mm 的薄墊片。

(2) 制備丙烯酰胺溶液：12.6 ml 20% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺 80:1）、14.4 ml 50% 甘油、2.2 ml 10X TBE 緩沖液、5.8 ml 水和 0.96 ml 10% APS 混合均勻。

(3) 將 0.36 g 瓊脂糖加入到 36 ml 水中，微波爐融化，等到瓊脂糖溫度降到大約 60℃ 時將其加入到丙烯酰胺溶液中。

(4) 加入 35 μl TEMED 混勻，立即灌膠，凝膠至少凝聚 1 h。

(5) 標準的寡核苷酸靶向的 RNase H 切割反應液加上 5 μl RNP 點樣緩沖液即可以直接作為電泳樣品，為了比較，將一份反應液用 75 μl 水稀釋，采用前面所述的方法制備 RNA [ 2 “RNA 的制備”中步驟 (1)~(3) ]，將 RNA 溶解在 10 μl 水中，加入 15 μl 的緩沖液 D 和 5 μl RNP 點樣緩沖液。

(6) 室溫下用 0.3X TBE 于 60V 預電泳 30 min。

(7) 點樣，在 175V （17 V/cm）電泳最少 4~5 h，直到溴酚藍染料到達凝膠底部。由于 RNP 片段大小的變化，可能需要更長的凝膠。凝膠溫度應該恒定，溫度升高可能導致 RNP 的變性。

(8) 電轉移將 RNP 中 RNA 從凝膠轉移到尼龍膜上，轉移需在 4℃ 60V 的恒壓條件下進行 5 h，必須確保轉移緩沖液溫度不會升高，必要時使用冷凝系統，轉移后的尼龍膜按以前所述的步驟進行操作 [ 4 "RNase H 切割產物——RNA 片段的分析” 中的（1）“Northern blot” 中的步驟 ④~⑦ ]。