RNA 免疫沉淀-隨機聚合鏈反應方法可用來鑒定細胞內 RNP 復合物中的 RNA 組分。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | RNA 免疫沉淀-隨機聚合鏈反應方法可用來鑒定細胞內 RNP 復合物中的 RNA 組分。 |
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| 實驗材料 | 載體酵母 tRNARQ1 DNA 酶糖原小牛腸堿性磷酸酶T4 DNA 連接酶JMJ09 感受態細菌 |
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| 試劑、試劑盒 | PBSNET-2 緩沖液RNase 抑制劑酚氯仿異戊醇乙酸鈉乙醇M-MLV 反轉錄酶反轉錄緩沖液通用引物-dN6RNase H電泳緩沖液非變性瓊脂糖凝膠上樣緩沖液EcoR Ⅰ限制性內切核酸酶EDTA |
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| 儀器、耗材 | 蛋白 A 瓊脂糖凝膠無 RNA 酶離心柱PCR 擴增體系Promega PCR 試劑盒pGEM-7Z 質粒載體Falcon 2059 聚丙烯管SOC 培養基LB 平板培養基fmol DNA 循環測序系統微型凝膠水平電泳儀紫外透射儀PCR 擴增儀高速低溫離心機低溫微型離心機臺式低溫離心機旋轉真空濃縮儀 |
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| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. 細胞提取物的制備
(1) 無菌 1X PBS。
(2) NET-2 緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.05% （V / V） NP-40。
(3) RNase 抑制劑。
2. 免疫沉淀
(1) 蛋白 A 瓊脂糖凝膠。
(2) 載體酵母 tRNA（1 mg/ml）。
(3) RNase 抑制劑。
(4) NET-2 緩沖液。
(5) RQ1 DNA 酶（Promega 公司）。
(6) 酚：氯仿 ( 1 : 1 )，避光保存。
(7) 氯仿：異戊醇 ( 24：1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 )。
(9) 糖原。
(10) 無水乙醇及 80% 乙醇。
(11) DEPC 處理的水。
3. RNA-rPCR 方法
(1) M-MLV 反轉錄酶和反轉錄緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl2，dNTP ( 每種 0.5 mmol/L），1 U RNase 抑制劑，50 U M-MLV 反轉錄酶。
(2) 通用引物-dN6：5' -GCCGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'。
(3) RNase H。
(4) 第二鏈 cDNA 合成：DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 大片段，10X DNA 聚合酶ⅠKlenow 大片段反應緩沖液，dNTP 混合液（每種 25 mmol/L）。
(5) 酚：氯仿（1 : 1），避光保存。
(6) 氯仿：異戊醇（24 : 1）。
(7) G-50、D-RF 無 RNA 酶離心柱（5-Prime，3-Prime 公司）。
(8) PCR 擴增體系：Taq DNA 聚合酶、10X PCR 緩沖液 [ 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，0.1% 明膠 ] 、dNTP 混合液（每種 10 mmol/ L）。
(9) 通用引物：5'-GCCGCCGAGTGCAGAATTC-3'。
(10) DEPC 處理的水。
(11) 電泳緩沖液：1X TBE。
(12) 10X 非變性瓊脂糖凝膠上樣緩沖液：0.25% 溴酚藍，0.25% 二甲苯青，15%（m / V）Ficoll 400，溶于去離子水。
4. 構建 cDNA 質粒文庫及轉化
(1) Promega PCR 試劑盒。
(2) EcoR Ⅰ限制性內切核酸酶。
(3) pGEM-7Z 質粒載體 ( Promega 公司）。
(4) 小牛腸堿性磷酸酶及其 10X 緩沖液。
(5) 0.5 mol/L EDTA。
(6) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(7) 氯仿：異戊醇（24 : 1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 )。
(9) 無水乙醇和 80% 乙醇，-20℃ 儲存。
(10) T4 DNA 連接酶及其 10X 緩沖液。
(11) JMJ09 感受態細菌。
(12) Falcon 2059 聚丙烯管。
(13) SOC 培養基。
(14) LB 平板培養基（100 μg/ml 氨芐青霉素）。
5. 克隆篩選
(1) TE 緩沖液：10 mmol/L Tris- HCl ( pH 7.4 )，0.1 mmol/L EDTA。
(2) PCR 反應體系，見3"RNA-rPCR 方法"。
(3) SP6 及 T7 啟動子引物。
(4) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(5) 氯仿：異戊醇(24 : 1)。
(6) 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2)。
(7) 非變性瓊脂糖凝膠。
(8) 電泳緩沖液 1X TBE。
(9) 10X 非變性瓊脂糖凝膠上樣緩沖液，見3 “RNA-rPCR 方法”。
(10) fmol DNA 循環測序系統（Promega 公司）。
6. 儀器
(1) 微型凝膠水平電泳儀。
(2) 紫外透射儀。
(3) PCR 擴增儀。
(4) 高速低溫離心機。
(5) 低溫微型離心機。
(6) 臺式低溫離心機。
(7) 旋轉真空濃縮儀（Speed-Vac concentrator）。
二、實驗方法
1. 細胞提取物的制備
(1) 培養 3~4 瓶 150 cm2 組織培養瓶的細胞。
(2) 用 10~15 ml 冰冷的 PBS 洗三次。用細胞刮刀收集細胞，用冰冷的 PBS 重懸細胞并將其轉移至 50 ml 的無菌離心管中。
(3) 于 4℃ 1000 g 離心 10 min。
(4) 用 0.5 ml 含有 100 U RNase 抑制劑的新鮮配制的 NET-2 緩沖液重懸細胞。
(5) 將細胞重懸液放置冰上超聲波處理，每次 5~10 s，共三次。
(6) 將經超聲波處理的細胞懸液轉移至 15 ml 耐壓透性玻璃管中，4℃ 10000 g 離心 10 min，回收上清液，用于免疫沉淀反應。上清液可凍存于 -80°C，但最好立即進行后續的操作。
2. 免疫沉淀
(1) 為從全細胞抽提液中去除同蛋白瓊脂糖凝膠非特異件結合的成分，在總細胞蛋白有 1~1.5 mg 的細胞抽提液中加入等體積蛋白 A 瓊脂糖凝膠，于 4°C 轉動混合處理 30 min。
(2) 4℃ 10000 g 離心 2 min，去除蛋白 A 瓊脂糖凝膠，回收上清液待用。
(3) 在處理過的細胞抽提液中加入特異性抗體，40 μl 1 mg/ml 酵母 tRNA 以及 30 μl RNase 抑制劑，于 4℃ 溫育 1 h，溫育時需輕柔翻轉混合。
(4) 加入細胞抽提液 2 倍體積的蛋白 A 瓊脂糖凝膠，輕柔混合，于 4℃ 溫育 30 min。
(5) 4℃ 10000 g 離心 2~3 min，用 350 μl NET-2 緩沖液洗滌沉淀至少 4~5 次。
(6) 加入 350 μl NET-2 緩沖液及酚：氯仿（1 : 1)，劇烈漩渦振蕩 1 min。
(7) 4℃ 10000 g 離心 5 min。
(8) 在水相中加入 10 U RQI DNA 酶，37℃ 溫育 15 min，去除污染的 DNA。
(9) 用等體積的酚：氯仿（1：1）進行抽提。
(10) 4°C 10000 g 離心 5 min。
(11) 再用等體積的氯仿：異戊醉（24 : 1 ) 抽提水相。
(12) 4℃ 1000 g 離心 5 min。
(13) 用 0.1 體積的 3 mol/L 乙酸鈉、2.5 體積乙醇及 20 μg 糖原沉淀 RNA。糖原有助于沉淀微量的核酸。樣品在干冰/乙醇浴至少放置 30 min。
(14) 4°C 10000 g 離心 30 min。
(15) 棄上清液，用 80% 乙醇洗滌沉淀。
(16) 4°C 10000 g 離心 5 min。
(17) 旋轉真空濃縮儀濃縮干燥，將沉淀溶于 15~20 μl 水中。RNA 可保存在 -80°C 備用。
3. RNA-rPCR 方法
(1) 取一半通過免疫沉淀制備的 RNA 樣品，于 65 ℃ 加熱 5 min 后迅速置于冰上冷卻。
(2) 將樣品進行反轉錄，總體積為 50 μl，反應體系為：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl2，dNTP ( 每種均為 500 μmol/L)，1 U RNase 抑制劑，50 U MMLV 反轉錄酶，150 ng 通用引物-dN6 ( 5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC- NNNNNN-3'）。
(3) 42℃ 溫育 1 h，反應結束后于 95 ℃ 加熱 3 min，迅速置于冰上冷卻。
(4) 加入 1 μl RNase H，于 37℃ 溫育 15 min，去除 RNA 鏈。
(5) 將樣品于 95℃ 加熱 3 min，置于冰上冷卻。
(6) 合成 cDNA 第二條鏈，在 41.5 μl 第一條鏈合成反應產物中加入 100 ng 通用引物-dN6（5'-GC- CGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'），95℃ 加熱 3 min，迅速置于冰上冷卻。加入 5 μl 10X Klenow 反應緩沖液，1 μl dNTPs ( 每種均為 25 mmol/L)，0.5 μl 100 mmol/L DTT，1 μl（6U） Klenow 酶，終體積為 50 μl。于 37°C 溫育 30 min。
(7) 先后用酚：氯仿（1 : 1 ) 及氯仿：異戊醇（24 : 1 ) 抽提樣品。再用無 RNase 的 G-50，D-RF 離心柱純化樣品以除去過剩的通用引物-dN6。
(8) 取 1/10 體積的雙鏈 cDNA 為 PCR 擴增模板，然后加入 10X PCR 緩沖液，2.5 μl dNTPs ( 每種 10 mmol/L)，100~200 ng 通用引物（5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC-3' ) 及 DEPC 處理水至總體積為 50 μl，最后加入 1.5 μl Taq DNA 聚合酶。擴增條件為：94°C 1 min，55℃ 1 min，72℃ 3min，共擴增 40 個循環。
(9) 為保證合成雙鏈 cDNA 的完整性，在 PCR 完成后再追加一個 PCR 反應。在 30 μl 的 PCR 反應液中加入 10X PCR 緩沖液、6 μl dNTP、100 ng 通用引物、3 μl Taq 酶，再加入適量的 DEPC 處理水至終體積為 300 μl。
(10) 輕輕混勻，于 94℃ 30秒，50℃ 1 min，72°C 2 min 的條件下擴增 3 個循環。然后再在 50℃ 1 min，72℃ 5 min 的條件下反應 4 個循環。
(11) 用等體積的酚：氯仿（1: 1) 抽提 PCR 產物，用 30 μl 3 mol/L 乙酸鈉及 750 μl 乙醇進行沉淀，將沉淀重懸于 20~30 μl DEPC 水中。
(12) 取 1/10 體積的 PCR 產物進行 1% 非變性瓊脂糖凝膠電泳分析。
4. 構建 cDNA 質粒文庫及轉化
(1) 用 PCR 產物回收試劑盒回收 cDNA，去除剩余的引物。
(2) 用 100 U 的 EcoR Ⅰ消化純化的擴增 cDNA 產物，終體積為 150 μl，于 37℃ 反應 2 h。
(3) 同時用 10 U 的 EcoR Ⅰ消化 500 ng 質粒 pGEM-7Z，終體積為 10 μl，于 37°C 反應 2 h。然后加入 2 μl 小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）、10 μl 10X CIAP 反應緩沖液，補加 DEPC 處理水至終體積為 100 μl，于 37℃ 溫育 30 min。加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA，于 65℃ 保溫 20 min 終止反應。
(4) 分別用等體積酚：氯仿（1 : 1) 抽提兩種 EcoR Ⅰ消化產物。
(5) 于 4℃ 10000 g 離心 5 min。
(6) 用等體積氯仿：異戊醇（24 : 1 ) 抽提水相。
(7) 于 4℃ 10000 g 離心 5 min。
(8) 于上清中加入 0.1 體積乙酸鈉及 2.5 體積乙醇，干冰/乙醇浴中放置 30 min 沉淀 DNA。
(9) 于 4℃ 10000 g 離心 30 min。
(10) 用 1 ml 80% 乙醇洗滌沉淀。
(11) 于 4℃ 10000 g 離心 5 min。
(12) 用旋轉真空濃縮儀干燥樣品，加 10~12 μl DEPC 處理水溶解沉淀。
(13) 把 1~5 ng EcoR Ⅰ處理的擴增 cDNA 與 100 ng EcoR Ⅰ處理并去磷酸化的 pGEM-7Z 載體用 T4 DNA 連接酶連接，加入 1.5 μl T4 DNA 連接酶及 1.5 μl 10X緩沖液，終體積為 15 μl。
(14) 室溫連接 3~3.5 h，樣品轉化前可保存于 4℃。
(15) 取 5 μl 連接產物加入到 100 μl JM109 感受態細菌中，輕輕混合，冰浴 30 min。
(16) 于 42℃ 熱休克 2 min。
(17) 迅速置于冰上 2 min。
(18) 加入 1 ml 預熱至 37 ℃ 的 SOC 液體培養基。
(19) 于 37°C，150~200 r/min，振蕩培養 1 h。
(20) 取 100 μl 均勻涂于 LB/氨芐平板培養基上。
(21) 37℃ 培養過夜。
5. 克隆篩選
(1) 用 PCR 方法鑒定插入片段的克降。用牙簽蘸取每個克隆加入 100 μl TE 中。
(2) 100℃ 加熱 10 min。-20℃ 保存模板待用。
(3) 混合 10 μl 模板、10 μl 10X PCR 緩沖液、8 μl dNTP( 每種 10 mmol/L）、100 ng SP6 啟動子引物、100 ng T7 啟動子引物、1 μl Taq 酶，補充無菌水至終體積為 100 μl。
(4) PCR 擴增，94℃ 40 s，50°C 1 min，72℃ 2 min，共 35 個循環。
(5) 用 1% 非變性瓊脂糖凝膠分析 PCR 產物。
(6) 取陽性克隆進行序列分析。 |
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