細胞中，蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外運，翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段，RNA 結合蛋白可以通過與 mRNA 的相互作用調控基因的表達。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭曉飛。
| 實驗方法原理 | 細胞中，蛋白質與 RNA 結合參與多種生理調控和發育過程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外運，翻譯起始及降解等過程中都存在著蛋白質與 RNA 的直接相互作用。在發育的各個階段，RNA 結合蛋白可以通過與 mRNA 的相互作用調控基因的表達。 |
|---|
| 實驗材料 | mRNA寡核苷酸 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | 工具酶二硫蘇糖醇無核酸酶去離子水乙酸鉀PCI 溶液NT2 緩沖液KNET 緩沖液 |
|---|
| 儀器、耗材 | 微離心管及加樣器吸頭Sephadex G-50 柱 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、材料與設備
1. mRNA（購自 Clontech 公司，也可自行純化獲取）。
2. 工具酶：Superscript Ⅱ 反轉錄酶和緩沖液（Life Technologies 公司），E.coli RNase H（Life Technologies 公司），未端脫氧核糖核酸轉移酶（Td Tase）和緩沖液（Life Technologies 公司），RNasin RNase 抑制劑（Promega 公司），Taq 酶。
3. 合成寡核苷酸（這里僅給出個例子）：
正向引物 [ oligo-dG ]：5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'
反向引物 [ oligo-dT ]：5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'
dNTP 混合物：10 mmol/L（dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均為 10 mmol/L）。
NTP 混合物：10 mmol/L（ATP、CTP、GTP、UTP 均為 10 mmol/L）。
4. 0.1 mol/L 二硫蘇糖醇。
5. 無核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微離心管及加樣器吸頭。
6. 無核酸酶去離子水。
7. Sephadex G-50 柱。
8. 蛋白 A-sepharose 凝膠珠（P3391，Sigma 公司）。
9. 3 mol/L 乙酸鉀（pH 5.2 )，100% 和 70% 乙醇，7.5 mol/L 乙酸銨，0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0），3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2）。
10. PCI 溶液：酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1，體積比），用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。
11. NT2 緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4 )，150 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，1 mmol/L MgCl2。
12. KNET 緩沖液：20 mmol/L KCl，80 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，0.05% NP-40，5 mg/ml mRNA，1 mmol/L MgCl2，2.5% 聚乙烯醇，0.2% 核苷氧釩復合物（vanadyl ribonucleoside complex，VCR），0.1 mg/ml 牛血清白蛋白，0.5 mg/ml 酵母 tRNA，10 mmoI/L DTT，80 U/ml RNasin。臨用前配制。
二、操作方法
實驗分 5 步進行：首先，用 oligo-dT 引物對 mRNA 進行反轉錄；然后在末端脫氧核糖核酸轉移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾；進而進行 PCR 擴增反應，在與 C-尾配對的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶啟動子序列；擴增獲得的 cDNA 再反轉錄合成 RNA；最后用靶蛋白質進行 RNA 文庫的篩選工作。
1. 反轉錄 mRNA 合成 cDNA
(1) 在 13 μl 預處理的水中加入 1~5 μg mRNA，1 μl（0.5 μg）oligo-dT 引物，輕輕混勻。
(2) 反應管于 70℃ 反應 10 min，冰上放置 1 min，瞬時離心，加入 2 μl 10X 反轉錄酶緩沖液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反轉錄酶（200 U/μl），總體積 20 μl。
(3) 輕輕混勻后離心反應管，室溫放置 10 min。
(4) 將反應管于 42°C 反應 50 min。70℃ 孵育 15 min 終止反應，將反應管轉移至冰上。
(5) 離心收集產物，加 1 μl E.coli RNase H（2 U/μl），37℃ 孵育 20 min。
(6) 將反轉錄產物通過 Sephadex G-50 柱去除殘余未反應的核苷酸。
(7) 加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鉀，乙醇沉淀單鏈 DNA。
2. 在 cDNA 庫末端加 C-同聚尾
(1) 用水重懸 cDNA（3' 末端濃度約為 40 pmol/ml）。
(2) 在 1.5 ml 離心管內進行末端脫氧核糖核酸轉移反應：10 μl 5X TdT 緩沖液，25 μl 100 μmol/L dCTP，cDNA，48.5 μl 水，1.5 μl (15U) TdTase；37℃ 反應 30 min。
(3) 將反應管置冰上，加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 終止反應。
(4) 加 60 μl PCI，充分混勻，15000 g 室溫離心 5 min。
(5) 取上層水相，通過 Sephadex G-50 柱去除未反應的 dCTP。
(6) 0.5 倍體積 7.5 mol/L 乙酸銨，2.5 倍體積乙醇沉淀 DNA。
(7) 14000 g 室溫離心 30 min，小心去除上清。
(8) 50 μl 水重懸 cDNA，20℃ 保存。
3. PCR 擴增 cDNA 庫
(1) 反應混合液：41.5 μl 水，10 μl 10X PCR 緩沖液，2 μl dNTP 混合液，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA，0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反應條件：94°C，1 min；50℃，1 min；72℃，2 min；25 個循環，然后 72℃，7 min。
(2) 1 μl 20U/μl Bam HI （或其他在引物設計時引入的內切酶，以去除 PCR 過程中可能產生的多聚體），37℃ 反應 1 h。
(3) PCI 抽提，0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉、2.5 倍體積無水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。
(4) 12000 g 4℃ 離心 10 min，小心去除上清。
(5) 70% 乙醇洗鹽，離心去上清，干燥后用 15 μl 水重懸核酸。
(6) 1% 瓊脂瑭凝膠電泳，切取 200~800 bp 的 DNA 片斷。
(7) 純化經過凝膠回收的 DNA，PCI 抽提，2.5 倍體積無水乙醇沉淀（冰浴 10 min )。12000 g 4°C 離心 15 min，小心去除上清。70% 乙醇洗鹽，離心去上清，干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重懸核酸。
4. cDNA 庫轉錄獲得 3' UTR 文庫
(1) 反應混合液：0.1 μg PCR 擴增得到的 cDNA 庫，4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶緩沖液，8 μl NTP，1 μl 40 U/μl RNasin，1 μl T7 RNA 聚合酶，加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反應 10 min。
(2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗鹽。將獲得的 RNA 樣品重懸于 20 μl DEPC-H2O。
(3) 取 2 μl 3% 瓊脂糖凝膠電泳觀察。
5. 用蛋白對 3' UTR 文庫進行篩選
(1) 蛋白對 3' UTR 文庫的結合
① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝膠珠，在 1.5 ml 離心管內用 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。
② 最后一次洗后留 100 μl 緩沖液，加入 2 μl 抗血淸。
③ 4°C 混勻至少 10 min。
④ 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。
⑤ 最后一次洗后留 100 μl 緩沖液，加入 5 μl 0.5 μg/ml 純化蛋白，4℃ 混勻至少 10 min。
⑥ 1 ml NT2 緩沖液洗 3 次。
⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 緩沖液重懸蛋白 A-sephrose 凝膠珠/抗血清/蛋白。
⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。
⑨ 室溫混勻 5 min。
⑩ 1 ml NT2 緩沖液洗 5 次。
⑾ 最一次洗后留 100 μl 緩沖液，加入 100 μl 水。
⑿ 200 μl PCI 抽提。
⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2（或 10 mmol/L tRNA )，20 μl 3 mol/L 乙酸鈉，700 μl 無水乙醇沉淀。
⒁ 70% 乙醇洗鹽，室溫干燥。
⒂ 14 μl DEPC-H2O 重懸。
(2) 反轉錄篩選獲得 3'-UTR
① 在 14 μl DEPC-H2O 重懸的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，10X 反轉錄緩沖液，1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl Superscript II 及轉錄酶（200 U/μl )。室溫孵育 5 min，42℃ 反應 50 min。
② 72℃ 反應 15 min 終止反應，將反應管轉移至冰上。
③ 將反應管離心，加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H，37°C 反應 20 min。
④ 將反應產物過 Sephadex G-50 柱兩次，徹底去除未反應的核苷酸。
⑤ 取 6 μl cDNA 產物進行 PCR 擴增（重復 PCR，反轉錄和篩選試驗直至獲得最終結果）。
如果采用高嚴謹性的篩選方法，可以只進行一次結合篩選操作。高嚴謹性的結合篩選條件包括提高鹽濃度（可高至 350 mmol/L），增加漂洗緩沖液中尿素的濃度（0.5~4 mol/L)。使用高嚴謹性條件進行一次結合篩選的優點除了省時省力之外，最重要的是可以降低由于 PCR 引入的錯誤。
可以在進行轉錄時加入同位素標記，比較同樣量篩選獲得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 庫能夠被蛋白沉淀的同位素活性，判斷是否篩選得到了特異性的蛋白結合 RNA。篩選得到的克隆可以通過 PCR 擴增時引入的限制酶位點克隆到 PGEM 或 pSP64 質粒中。挑單克隆抽提質粒，測序，進行 BLAST 分析。
這里介紹的是從大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 庫中篩選 RNA 結合蛋白的作用靶的方法。一定要注意將篩選得到的結果與生物學功能相聯系。如果某蛋白與一已知靶 RNA 的 RNA 結合蛋白高度同源，可以考慮直接檢測此蛋白是否也具有結合同一靶 RNA 的能力。如果從隨機 RNA 文庫中篩選得到一定的位點規律，也可以應用于按照規律尋找已知蛋白的其他靶標 RNA。在體外實驗確證蛋白與 RNA 間的相互作用后還需要用體內方法（梯度離心，免疫共沉淀結合 Northern 雜交，RT-PCR，RNase 保護法等）進行進一步確認。 |
|---|
