RNA在脊椎動物胚胎和器官中整體標本原位雜交檢測實驗1

轉錄的時空分布（如胚胎發生過程中）情況可以為研究編碼基因產物的功能及與其他基因之間可能的相互作用提供重要的線索。來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版

小鼠或者雞的胚胎以及器官中的整體原位雜交

• 實驗方法原理
  實驗材料	小鼠或雞的胚胎或器官
  試劑、試劑盒	PBS 冰預冷PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20 4℃及室溫4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS (4% PFA) 4℃PBT中溶25%、50%、75%的甲醇（甲醇 PBT)100%甲醇PBT中溶6% (V V)過氧化氫（H2O2; Aldrich)(可選）
  儀器、耗材	解剖工具（如剪刀和鑷子）70%乙醇浸泡解剖顯微鏡20 ml咬合蓋（snap-cap)玻璃小瓶小勺或者刮鏟用來放置2 ml小離心管的帶有適配器的加熱板旋轉平臺（Rocker platform)
  實驗步驟	1) 如果有必要的話，在冰冷的PBS溶液中，使用合適的解剖器具在解剖鏡下將小鼠或雞的胚胎切成小塊。完全除去胚胎外膜和胞衣。打開腔。 2) 將樣本轉移到裝有10 ml左右冷的4%多聚甲醛的20 ml咬合蓋玻璃小瓶中。4℃固 定4 h到過夜。 3) 4℃下用PBT洗樣本兩次。即使樣本不做存儲立即使用，也建議進行脫水、水化和漂白步驟（步驟4?8)，這些步驟可以改進組織的浸透性并且增加方法的靈敏度。也可以選擇胚胎直接從步驟8開始操作。 4) 室溫下分別用25%、50%和75%的甲醇/PBT洗樣本，最后用100%甲醇再洗2次 以達到脫水的目的。 5) 室溫下使用甲醇/PBT溶液以相反的步驟洗樣本，最后再用PBT洗2次以水化樣本。 6) 可選步驟：用含有6%雙氧水的PBT溶液室溫下漂白樣本15 min。 7) PBT溶液洗樣本3次。 8) 用溶于PBT中10μg/ml的蛋白酶K室溫下消化樣本15 min。 9) 用新鮮配置溶于PBT中的2 mg/ml甘氨酸洗樣本以終止消化。 10) PBT洗樣本2次。 11) 新鮮配制的0.2%戊二醛/4%多聚甲醛/PBT再在室溫下固定樣本20 min。 12) PBT 洗 3 次。 13) 向玻璃小瓶中加1 ml預熱的預雜交溶液A，然后轉移樣本到2 ml離心管中。 14) 移除溶液然后加2 ml新鮮配置并預熱的預雜交溶液A。蓋上蓋子，放在65℃加熱 板上并確保蓋子不暴開。將加熱器的側面連在旋轉平臺上。65℃預雜交樣本3h。 不管是在步驟14以前還是以后，樣本都可以在預雜交溶液中-20℃保存6個月。 15) 移除預雜交溶液，加入1 ml含有1μg /ml地高辛標記核酸探針的雜交溶液A，70℃雜交過夜 對于3個10. 5天的小鼠胚胎、2個11. 5天小鼠胚胎或者5個17期的雞胚胎來說，1 ml的雜交溶液就足夠了。 16) 接下來用酶探測RNA雜交物 收起
  注意事項
  其他	其他試劑： PBT中溶10μg/ml蛋白酶K，沒有預先消化的 PBT中溶2 mg/ml甘氨酸（Merck) 新鮮配置，PBT中溶4% (m/V)高聚甲醛和0.2% (V/V)戊二醛（EM級，Sigma) 新鮮配制預雜交溶液A，雜交溶液A:在預雜交溶液A中加入終濃度1μg/ml的地高辛標記的核酸探針

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