基于PCR的DNA斑點印跡實驗

dNTPPCR 緩沖液聚合酶混合液嵌套引物LB-氨芐液體培養基溶液NaOHSSCTris-HClPCR 產物

微量滴定板尼龍膜紫外交聯裝置96 孔或 384 孔復制器熱循環儀PCR 管或反應板

第 1 階段：通過 PCR 擴增 DNA 插入片段

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP, 每種為 10 mmol/L)

2. 酶和酶緩沖液

10XPCR 緩沖液（40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸鎂,10 mmol/L 乙酸鉀，75 mg/mlBSA, 或者廠商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相當產品）

3. 核酸和寡核苷酸

嵌套引物 NP1*

嵌套引物 NP2R*

*或者，載體上插入位點兩側的引物也可以用來進行 PCR 擴增插入片段。

4. 培養基

LB-氨芐液體培養基

配制 1L 培養基，在 950 ml 無離子水中溶解 10 g 細菌用胰蛋白胨、5 g 細菌用酵母提取物、10 gNaCl,用 5mol/LNaOH 調節 pH 到 7.0。用無離子水將體積補到 1L。在 151bf/in2(llbf/in2=6894.76Pa)下高壓滅菌 20 min。髙壓滅菌后的培養基冷卻后，加入氨芐西林，使終濃度為 50ug/ml。

5. 專用設備

熱循環儀

在這一階段，PCR 在板子上進行，而且不得要以前的精確度，因而沒有必要使用礦物油。

PCR 管或反應板

6. 附加試劑

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備

7. 細胞和組織

cDNA 文庫，存在于合適的菌株中，以菌落的形式生長在 LB 瓊脂平板上

二、方法

1. 從文庫中隨機挑取 96 個或 384 個白色的細菌菌落。

2. 在一個 PCR 板上，每個菌落用 150ulLB-氨芐培養基 37°C 下輕輕振蕩培養，時間至少為 4 h(或過夜）。

3. 配制用于 100 個或 400 個 PCR 的主體混合液。



4. 將 19ul 主體混合液分裝到每個管子或反應板的每個孔中。

5. 從每個細菌培養液（見上面第 2 步）中，各取 1ul, 加到裝有主體混合液的各 PCR 管或 PCR 板的各個孔中。

6. 用下面的條件，不使用礦物油在熱循環儀中進行 PCR。



7. 從每個反應中各取 4ul 在 2% 瓊脂糖凝膠上分析。

第 2 階段：斑點印跡分析

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

0.6mol/LNaOH(新鮮配制，或從濃的儲存液中新稀釋）

SSC，20X(1L 配方：175.3 gNaCl 和 88.2 g 檸檬酸鈉，pH7.0)

0.5mol/LTris-HCl，pH7.5

2. 核酸和寡核苷酸

PCR 產物

3. 專用設備

微量滴定板

尼龍膜

紫外交聯裝置（比如 Stratagene 的 UVStratalinker)，或 68°C 烘箱

96 孔或 384 孔復制器

二、方法

1.從每個 PCR 產物中，各取 5ul, 與 5ul 0.6mol/LNaOH 混合。

2.從每個混合液中，各取 1~2ul 到尼龍膜上。這一步可以使用 96 孔或 384 孔復制器在用作 PCR 擴增的微滴定板相應的孔中蘸一下，再點到一塊干的尼龍膜上。至少點 2 張同樣的膜，分別用來與正向和反向消減探針進行雜交（方案 1 第 3 階段）。強烈推薦點 4 張相同的尼龍膜。2 張與正向和反向的消減 DNA 進行雜交，另外 2 張與最初的 cDNA 或基因組 DNA 進行雜交。

3.用0.5mol/LTris-HCl(pH7.5) 中和 2~4 min, 并用 2XSSC 洗滌。

4.用紫外交聯裝置（比如 Stratagene 的 UVStratalinker) 將 DNA 固定在膜上，68°C 烘烤 4 h。