| 實驗步驟 | 1.溶解
樣品溶解是 2-DE 成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。最為普遍應用的 2-DE 蛋白質溶解方法仍然是以下幾種物質的混合液（所謂“裂解緩沖液"), 9.5 mol/L 尿素， 4% (m/V) 的 NP40 、 1%(m/V) 的還原劑二硫蘇糖醇 (dithiothreitol, DTT) 以及 2% (m/V) 相應 pH 范圍的SCA。該配方適用于許多類型的樣品，但并不是一種萬能方法，其中在膜蛋白質的提取上就對此方法提出了挑戰, 此后發現兩性去污劑 CHAPS 可以有效溶解膜損白質, 特別是在濃度為 4% (m/V), 與 2mol/L 硫脲和 8mol/L 尿素混合物共用時。硫脲是一種比尿素具有更強能力的變性劑，但由于其水溶性差，不能單獨使用，但在尿素濃溶液中其可溶性更好，因此尿素-硫脲混合物提高了溶解樣品的能力令線性磺基三甲胺乙內酯 (sulphobetaine) 去污劑，如 SB3-10 或 SB3-12, 也見有效的溶解劑，但這些試劑與高濃度尿素不兼容, 當它們以 2% (m/V) 的濃度與 l mol/L尿素、 2mol/L 硫脲和 2%CHAPS 結合在一塊使用時可以克服這此困難 。去污劑 SDS 能破壞大多數非共價蛋白質相互作用，對于膜蛋自的溶解非常有效但找陰離子特性使它不可能應用于 IEF 凝膠。但是， SDS 可用于 2-DE 前的前期溶解過程，在該方法中，樣品首先用 l%(m/V) SDS 溶解、然后用常用溶解液（如裂解液）稀釋，目的是為（用非離子或兩性去污劑從蛋白質中置換出 SDS, 從而使蛋白質保持在溶解狀態。為了有效地溶解樣品，并減少 SDS 在 IEF 中的負作用，必須認真控制蛋白質與非離子或兩性去污劑的比例 (1：3) 及 SDS 與非離子或兩性去污劑的比例 (1：8),核酸對于 IEF 可能造成的問題，是因為它會導致樣品黏度的增加且在某些情況下可與樣品蛋白質形成復合物，進而導致假象遷移和條紋的出現。如果懷疑上述問題可能出現，最好向樣品溶解液中加入適當純的（不含蛋白酶）內切核酸酶來降解核酸，或是利用 SCA 和核酸結合形成復合物的能力通過超速離心來去除復合物.
2.還原
蛋白質二硫的通常用 DTT 或 β-巰基乙醇等含自由巰基的試劑還原，, 但是 DTT之類的試劑帶電，因此在 IEF 過程中遷移到膠外，導致樣品蛋白質的重氧化使得電泳過程中蛋白質溶解性喪失，最近報道用不帶電荷的還原劑如三正丁基膦取代含巰基試劑大大增強一向 IEF 中蛋白質溶解能力，并使得一維到二維轉移效率提高 展開 |
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