一、通過擴散來洗脫凝膠中的蛋白質將 SDS 從蛋白質中移除的早期方法由 Weber 和 Kutter(1971) 發表，但當用于微量的蛋白質時，這個方法既麻煩又會造成大部分蛋白質的損失。 這一領域較多的早期方法已經發表（HagerandBurgess,1980)，但卻需要重新討論 (butbearsrevisiting)。基本步驟包括凝膠電泳本身、將目標蛋白質在凝膠中定位、從凝膠中洗脫蛋白質、移除 SDS 及復性蛋白質以進行隨后的研究或使用。 1.凝膠的制備和蛋白質的保護最近似于標準的話，各種凝膠配方中的任意一種均可以使用。其中有一些需要重點考慮的地方。聚丙烯酰胺凝膠的聚合過程涉及自由基的產生以推動聚合反應發生。因此，在灌膠時應該等待至少 12 h 以確保聚合作用完成。由于反應初始會創造出一個氧化環境，你需要采取預防措施來保護蛋白質不被氧化。這很容易完成，可將廉價而分子質量小的，在電泳時跑在大多數蛋白質前面的內部載體蛋白質 (如β乳球蛋白）加入到將要上樣的樣品中; 這些載體蛋白會消耗掉凝膠中殘留的氧化劑。同樣還需要在上層液池里的緩沖液中加人陰離子巰基復合物 (我們使用 0.1 mmol/L 巰基乙酸鈉），它們會在電泳過程中穿過凝膠，破壞凝膠中任何具有潛在氧化能力的物質和剩余的自由基。半胱氨酸同自由丙烯酰胺反應會產生半胱氨酸-S-丙酰胺，凝膠中若含有巰基也可以減少此反應 (Chiarietal.，1992)。 應該選用只含有十二烷基形式 (C12) 的高質量 SDS，因為不純的 SDS 可能含有不同量的 C14 或 C16, 它們對蛋白質的結合比 C12 更強，且非常難于去除 (KunitaniandKresin，1989)。 2.蛋白質在凝膠中的定位凝膠電泳開始后，就需要確定凝膠中的含有目標條帶或特定分子質量條帶的位置。 當然，如果你不知道你的酶條帶的大小，你可以將凝膠切成幾部分，將每一部分的蛋白質洗脫出，并對所有部分都進行酶活性分析。起初，我們通過將凝膠浸泡在冷的 0.25mol/L KCl 中 5 min, 再用冷蒸餾水脫色 ih 來確定我們所感興趣的條帶。現在我們知道，你幾乎可以用任何方便的方法來對凝膠染色，包括鋅-咪唑（CastelIanos-SerraandHardy，2001) 法; 或是使用新的非常敏感的熒光蛋白染料，如 SYPRORuby(詳見第 31 章)。甚至你可以使用考馬斯亮藍染料。在—次實例中，我們成功地對經考馬斯亮藍染色、服色、干燥，保存 10 年的條帶完成了復性！另外一種方法是在凝膠側翼泳道上對有顏色的標準分子質量蛋白質 (可從許多公司獲得) 進行電泳。這種方法可以指導我們根據分子質量信息將凝膠的特定部位切割出來。 3.通過擴散來洗脫蛋白質人們常常會忽視這一簡單的步驟，該步驟廉價、有效, 并且能夠同時處理多個樣品。 下述典型的方案是基于 Hager 和 Burgess(1980) 所述方法修改而成。 (1) 用冷的雙蒸水沖洗 SDS 凝膠, 冰冷的 0.25mol,7LKCl 和 1 mmol/L DTT 染色 5 min，確定條帶位置。用雙蒸水沖洗并用冷雙蒸水和 Immol/LDTT 脫色 10~60 min。 或者，可以將一個凝膠泳道劃分成許多 3~5 mm 長的部分，將每一部分放人試管中, 按上述方法清洗。 (2) 將凝膠薄片碾碎于 ImL 洗脫緩沖液中。最初我們使用一種 3.5 mL 的硅化處理的 Pyrex 玻璃試管（10 mmX75 mm) 和小型 Teflon 研磨棒（Kontes，K886001size19)，但如今采用 0.3 mL 的洗脫緩沖液、1.5 mL 聚丙烯離心管和一次性聚丙烯研磨棒（如 Kontes 搗碎棒，K749521-1500)。洗脫緩沖液為 50 mmol/LpH7.9 Tris、0.1 mmol/LEDTA、Immol/LDTT，0.15mol/L NaCl、25~100ug/mL BSA(可不加) 及 0.1% SDS。 (3)—旦凝膠被碾碎，需將小的凝膠碎片在旋轉器中孵育 1~8 h 使其被動擴散。在 Hager 和 BUrgess(1980) 的方法中，洗脫動力學表明 8.75% 聚丙烯酰胺凝膠介質中，36kDa 多肽的洗脫半衰期小于 30 min,150kDa 多肽的洗脫半衰期為 1?I.5 h(完全洗脫分別需要 4 h 和 16~24 h)。 (4) 將混合物在離心機中以最大速率離心 2 min, 使破碎的凝膠沉淀。隨后將上清 (蛋白質洗脫液) 轉移到干凈的微量離心管中。 4.SDS 的移除和來縮由于洗脫效率在洗脫緩沖液中含有 0.1%SDS 時為最高，所以在洗脫之后必須移除 SDS。丙酮沉淀法是最有效的方法, 不僅移除了 SDS, 而且還濃縮了蛋白質。基于 Hager 和 Burgess(1980) 的典型步驟如下所述。 (1) 將 4 倍體積的冷丙酮 (-20°C) 加入到蛋白質洗脫液中，使樣品在干冰-乙醇浴中沉淀 30 min。由于樣品會在干冰-乙醇冰浴中凍結，在離心前要把樣品短暫地放在冰水浴中解凍。 (2) 離心機中用最大離心速率離心 5 min。移除并丟棄上清液。在采用 0.16 放射性 RNA 聚合酶的測試實驗中我們發現，當洗脫緩沖液中的載體 BSA 濃度為 0ug/mL、15/ng/mL 和 100pg/mL 時, 聚合酶相應的回收率為 71%、90% 和 99%(HagerandBurgess,1980)0(3) 測試表明 99.9% 以上的 SDS 留在丙酮上清液中。可以通過使用 ImL 冰冷的 80% 丙酮清洗沉淀，再次離心以清除殘余的 SDS。 5.酶活性的恢復(1) 丙酮沉淀物需干燥 10 min。 (2) 沉淀物在含有 206mol/L 的鹽酸胍 (GuHCl) 的稀釋緩沖液 [稀釋緩沖液為 50 mmol/LTris(pH7~9)、20% 甘油、0.Immol/LEDTA、1 mmol/LDTT、0.15mol/LNaCl、20?100fxg/mLBSA(可不加）和 0.1% SDS 中溶解并變性。溶解作用在室溫下 20 min 之內發生。 (3) 通過加入 I.0 mL 稀釋緩沖液迅速將溶解的蛋白質稀釋 50 倍, 室溫下復性 1~12 h。 (4) 通過恰當的分析方法對復性的蛋白質進行分析。 6.目標酶的預實驗對目標酶進行初步實驗，觀察其在 6mol/L 及稀釋后的鹽酸胍中否具有復性的能力，以此可測試指定蛋白質的復性能力。如果恢復良好, 再對其在 SDS 洗脫緩沖液中變性，丙酮沉淀，6mol/L 鹽酸胍溶解和稀釋后的活性恢復進行測試。 7.方法的局限性盡管擴散洗脫法用途很廣, 但并不能適用于所有的酶。如果酶活性是依賴于兩個或更多不同大小的多肽，或需要可分離的輔因子, 如亞鐵血紅素 (在 SDS 凝膠電泳過程中會離開催化蛋白質) 時，該方法無法使用。如果蛋白質具有可能影響再折疊的翻譯后修飾，如糖基化或蛋白酶解加工，或存在一些難于改進的必要二硫化物時，該法同樣難以使用。 8.眾多應用即使有上述的局限性, 擴散洗脫法已使很多蛋白質成功復性。這包括 DNA 拓撲異構酶、DNA 連接酶、細菌 a 因子 (Haldenwangetal.，1981;Wiggsetal.,1981)、真核轉錄因子、H-RasGTP 酶、甲基還原酶、著絲粒結合蛋白和蛋白質/RNA 核糖核酸酶的蛋白質組分。該法已經用于細菌、酵母、人、果蠅及許多其他物種的酶類。該法還可用于含有多個相同亞基的酶。如果將適當的凝膠切片混在一起，該法還可用于含有不同亞基的蛋白質。本法已經成功用于含有必需的 S-S 橋的蛋白質。 二、用反相 HPLC 代替 SDS 凝膠電泳法上述討論的對 Hager 和 Burgess 方法的巧妙改動已經由 Prokipcak 等（1994) 發表。 他們將 SDS 疑膠和丙酮沉淀法替換成反相高效液相色譜法 (Rp-HPLC) 和凍干法。將蛋白質應用到一臺 C4 反相高效液相色譜儀中，以 0%~50% 乙腈/0.1％TFA 的梯度進行洗脫。洗脫后的蛋白質組分經凍干, 在小體積的 6mol/L 鹽酸胍中重懸，稀釋至再折疊，并進行酶活性分析。 三、電泳洗脫上述方案詳細描述了利用擴散法洗脫凝膠中的蛋白質，許多操作應該完全適用于電泳洗脫。比起擴散法，盡管這些方法會在較短時間內較高效率的完成洗脫，但它們卻更加昂貴并難以擴大規模以應用于多個凝膠片。 SchleicherandSchuellElutrap 和 Bio-RadModel422Electroeluter? 是兩種應用最廣的商業電泳洗脫裝置。這兩種裝置均涉及將含有目標蛋白質條帶的凝膠片放入裝置，以及通過蛋白質電泳使蛋白質從凝膠片中洗脫出來的步驟，蛋白質通過大孔薄膜或玻璃篩 (frit)，進人帶有只允許小分子或小于約 5kDa 的蛋白質通過的小孔薄膜的小室。用移液器將目標蛋白質從小室中吸出并按要求使用。這些商業產品更為詳細的使用方法可以從 Harrington(1990) 及 Seelert 和 Krause(2008) 的優秀綜述中和公司資料中找到。 另外一種商業方法為 ProteoPLUSelertoeluter。一個小螺帽試管中裝入上游和下游蛋白質截留膜, 這些膜在將試管放于電泳時它會允許電流通過。在蛋白質從凝膠片中洗脫出后，可在同一試管里進行透析以供后續使用。該方法應用的一個例子由 Lei 等 (2007) 給出。 Bio-RadWholeGelEluter 的一整塊平板凝膠可電轉移成 26 個部分。通常一個蛋白質樣品上樣于一個凝膠寬度的泳道上，進行 SDS 凝膠電泳。Eluter 的 26 個凹槽平行于蛋白質條帶。蛋白質轉移出凝膠后，進入到凹棺中，并進入收集箱。 另一項近期研究進展包括將一整塊平板凝膠的多個單獨組分洗脫人多孔板中，以用于蛋白質組學分析 (Antaletal.,2007)。 四、總結高分辨率凝膠電泳分離的蛋白質條帶可以從凝膠中回收并用于大量應用中。通過壓碎凝膠，使蛋白質從凝膠中擴散出來以完成從凝膠片中洗脫蛋白質; 或者可給凝膠片加上電場，將洗脫出的蛋白質捕獲在合適的膜結合裝置上。可以獲得亞微克至 100ug 蛋白質，通常會將其復性來獲得酶活性。 展開 | 