| 實驗步驟 | 一、早期染色方法
用染料和生物大分子結合形成有色的復合物是電泳后檢測最常用的方法。選用染料通常應考慮以下要求：
1. 必須與大分子結合以形成一個不溶性的，有色的，緊密的復合物，但不結合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則高背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描。
2. 染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中，以利于背景的脫色。
3. 選用高吸光系數的染料有利于提高定量測定的靈敏度。
4. 選用能與大分子有專一性結合的染料，并在結合后能產生不同的顏色（如熒光)，可以提高檢測的選擇性和靈敏度。
早期用于蛋白染色最常用的染料是氨基黑 10B (amido black 10B)、萘黑12B 200 (naphthalene black 12B 200)、萘酚藍黑 6B (naphthol 6B)、水牛黑（buffalo black)、滂酰藍黑 SC 或 SX (pontacyl blue black SC or SX)。氨基黑是一種含有兩個 SO3H 基團的酸性重氮化合物，所以能被結合到蛋白質的陽離子基團上。
用 7% 醋酸或 5:5:1 體積比的水：甲醇: 冰醋酸的混合溶劑配制 1% 氨基黑溶液，過濾后備用。將凝膠在染液中浸泡 2~6 小時，然后用上述溶液脫去背景。
如欲加速染色，可以加溫。由于水、甲醇、醋酸混合溶劑的輕度水化作用，凝膠有時會收縮，所以需要根據凝膠的濃度，大小和形狀來控制染色和脫色的時間。
使用氨基黑染色會對以后的定量測定帶來一些問題。這是因為：
1. 定量測定受不同廠家和批號的染料的影響；
2. 不同的蛋白結合不同量的染料，可以呈現不同的顏色，如藍黑色或棕色，所以每個組分需要自己的標準曲線；
3. 染色的不均一性和高背景使得用氨基黑染色得到的掃描面積不僅決定于蛋白量，而且決定于遷移距離以及區帶周圍的背景。Racusen 根據他的實驗數據，1 mol/L 的堿性氨基酸結合 0.56±0.6 mol/L 的氨基黑，建議將電泳后的凝膠浸在 0.01% 氨基黑（在 7% 醋酸中）中至少 16 小時，并加熱，攪拌。
二、考馬斯亮藍染色
在蛋白染色方法中，目前以考馬斯亮藍染色最為常用。因為它既克服了氨基黑染色靈敏度不高和進行定量掃描的限制，又比下一節將介紹的銀染色方法簡便。
考馬斯亮藍染色首先是由 Fazekas 等在 1963 年用于醋酸纖維素膜電泳, 并認為同樣可用于紙電泳，瓊脂電泳和淀粉凝膠電泳。1965 年 Meyer 等將此方法用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。檢測靈敏度約為 0.2~0.5 μg。
考馬斯亮藍 R-250 (coomassie brilliant blue R-250) 即二苯基甲烷（triphenyl-methane)。 每個分子含有兩個 SO3H 基團，偏酸性， 與氨基黑一樣也是結合在蛋白質的堿性基團上。在一定 pH 時，這種染料-蛋白復合物被完全解聚。考馬斯亮藍 R-250 與不同蛋白結合呈現基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內 (15~20 μg)，掃描峰的面積與蛋白量有線性關系。對一些蛋白，如尿素酶，線 性范圍甚至為 1~55 μg。考馬斯亮藍又分為 R-150、R-250、R-350、G-250 等。其中 R-350 最為靈敏，R 為紅藍色，G 為藍綠色。考馬斯亮藍 G-250 即二甲花青亮藍（Xylene Cyanine Brilliant Blue G250), 是一種甲基取代的三苯基甲烷。考馬斯亮藍 R-250和 G-250 的結構式如圖 4.13。不同的配方，不同的染色方法適合于不同性質的蛋白，有關考馬斯亮藍的染色方法見 Righetti 的綜述。
考馬斯亮藍有兩種染色方法：一種是先固定，再進行染色和脫色。第二種是同時進行固定和染色，再脫色。固定液、染色液、脫色液的配法很多，方法也很多。表 4.9 列示三種方法供參考，表中方法一和方法三固定較好，方法二則比較簡便快捷，且在系統中不使用甲醇。固定和染色的時間，特別是后者，取決于凝膠的厚度、孔徑及有否支持膜。固定的時間可以長一些。染色時間不宜過 長，否則增加脫色的困難。Fishbein 的實驗證明，染色時間超過 12 小時，染色強度不會增加。為了加速染色和脫色過程，可加溫和攪拌染色液和脫色液。在染色后，脫色前用脫色液浸濕的棉花球輕輕擦洗凝膠表面，除去染料顆粒，可使脫色的凝膠清晰明亮。這是常用的擴散脫色法。如果有條件也可以用電泳脫色法。因為考馬斯亮藍是偏酸性染料，可將染色后的凝膠放在有孔的塑料片之間, 系統中充以 7% 醋酸。水平電極置于兩側，并與一個大電流的電源相連接。這樣脫色便可在 15~30 分鐘內完成。
Sreeramulu 等報道用 0.5 mol/L 氯化鈉的水溶液（濃度范圍 0.1~2 mol/L) 作為脫色液，只需 2~3 小時就可看到紫藍色的蛋白帶。
由于常規聚丙烯酰胺凝膠電泳的系統中沒有 SDS，所以染料貯液可以重復使用。如果貯液中出現顆粒，可以過濾除去。只是重復使用的染液不能控制濃度, 不利于定量測定。用過的脫色液可以用活性炭吸附過柱，以節省溶劑。
對堿性蛋白和低分子質量多肽的檢測，Steck 等認為最好使用甲醛固定。 因為甲醛能交聯蛋白和聚丙烯酰胺凝膠，使蛋白不會在染色時丟失。
考馬斯亮藍染色的第二種方法是同時進行固定和染色。考馬斯亮藍 G-250 常用這種方法。這種方法的特點是快而簡便，有時甚至不需脫色。靈敏度略遜于 R-250。Blakesley 等報道整個染色過程只用 30 分鐘，可檢測大于 1 μg 的蛋白。 Vesterberg 介紹了三種 G-250 染色方法，檢測靈敏度可優于 0.2 μg, 最快染色過程也只需 1 小時。在這類方法中，常將考馬斯亮藍溶于三氯醋酸或過氯酸中，在這兩種溶劑中，考馬斯亮藍是很難溶解的，結果形成的主要是染料和蛋白質的復合物，所以染色很快。在 Reisner 的實驗中可以看到染料在稀過氯酸溶液中和結合到蛋白上時呈現的顏色變化，且富含賴氨酸的組蛋白由于可溶解于過氯酸不能被檢測，但能選擇性地檢測到富含精氨酸的組蛋白。表 4.10 列示三種方法供參考使用。
考馬斯亮藍 G-250 對小肽染色備受青睞。常用的方法是將 2 g 考馬斯亮藍 G-250 溶解在 1 L 蒸餾水中，再加 1 L 1 mol/L 硫酸。攪拌 3 小時后過濾，此時溶液為棕色。再加 220 ml 10 mol/L 氫氧化鈉。最后，再加 310 ml 100% 三氯醋酸，此時溶液為藍綠色，備用。將凝膠在 50℃，浸染 3 小時或在室溫過夜，就可見到藍綠色的蛋白帶。再用蒸餾水漂洗凝膠約 1 小時，蛋白帶更為清晰。使用此方法能將 10~15 個氨基酸的寡肽進行固定和染色。作者曾用此方法檢測大米中的醇溶蛋白和低分子質量的蝎毒蛋白，結果是非常理想的。
三、銀染色
1979 年 Switzer 和 Merril 等首先在 “Analytical Biochemistry” 上介紹了比考馬斯亮藍染色靈敏 2 個數量級的銀染色方法，它可以檢測小至 0.38 ng/mm2 的牛血清白蛋白。這個方法接著在 1980 年由 Oakley 等進一步發展以達到簡化程序和低消耗的目的。有關這個方法的研究很多，可參見 Dunn 和 Merri 的綜述。Ohsawa 等報道了一種改進的銀染方法，可檢測小至 10-15 g ( femtograms, 飛克）的蛋白。由于銀染的靈敏度高，各大公司均生產銀染試劑盒。
銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。用銀染蛋白的吸光度對它們的濃度作圖呈現不同的斜率，表明染色的程度是與蛋白中的一些特殊基團有關。研究還表明喊性和含硫氨基酸在銀染中的重要性，所以不含或只含很少胱氨酸殘基的蛋白質有時是呈負染。目前對銀染的詳細機制還不是非常清楚。
在銀染過程中，蛋白質首先需要被固定。固定有兩個作用，第一是把蛋白固定在凝膠中或至少是阻滯它們在凝膠中的擴散。第二是為了去除干擾染色過程的物質，如去污劑、還原試劑和緩沖液的成分（如甘氨酸)。常用的固定劑有戊二醛、乙醇、甲醇、醋酸以及三氯醋酸, 然后將凝膠放在銀染溶液中顯色。
目前的銀染方法可以分為兩大類，化學顯色（chemical development) 和光顯色（photodeve lopment)。化學顯色方法又進一步分為雙胺銀染法（diamine silver stains) 和非雙胺化學顯色銀染法（non-diamine chemical development silver stains)。雙胺銀染色是用氫氧化銨形成銀-雙胺復合物。將固定后的凝膠浸泡在這個溶液中，并通過酸化（通常用檸檬酸）使其顯像，現在被廣泛使用。Oakley 和 Wray 的方法即屬于這一種。
非雙胺化學顯色銀染法是將固定的凝膠放在酸性的硝酸銀中，在硝酸銀和蛋白質發生作用后，在堿性 pH, 用甲醛還原離子化的銀成金屬銀來達到顯像的目的。Sammons 等報道的這種方法比 Oakley 等和 Morrissey 的方法靈敏 10 倍，通常用酸化（檸檬酸或醋酸）停止顯色。用碳酸鈉處理凝膠可以進一步增強染色的強度。
光顯色方法是使用光能還原銀離子成金屬銀。因為光能夠在酸性 pH 還原銀，所以一旦凝膠被固定，光顯色方法染色能使用單一染色溶液，而不像化學染色程序那樣通常至少需要兩種溶液。
大部分蛋白使用銀染時顯示棕色或黑色，但是有一些銀染方法會產生各種顏色，而且以此可以辨別不同的蛋白。例如 Goldman 等發現一些脂蛋白呈現藍色，一些糖蛋白呈現黃、紅或棕色。銀顆粒由小變大時，顏色可由紅/黃通過藍變成黑。帶電氨基酸側鏈的變化也是銀染顏色變化的關鍵。此外，銀顆粒在凝膠中的分布也會影響顯色，所以在電泳帶中的蛋白量也是影響因子。
表 4.11 所示為 Wray 等雙胺銀染方法，適合于復雜蛋白質混合物。但在大部分情況下采用多色銀染，見表 4.12。因為它能提供更多的信息以辨別不同的蛋白。而且由于顏色對比，有時能檢測到最小量的蛋白。用這種銀染方法有五種基本的色調，黑、藍、棕、紅或黃。這個方法的最大優點是比單色銀染更加靈敏。
由于塑料容器可能有痕量的有機化合物干擾銀染色，所以染色過程應采用玻璃容器。另外，水的純化對銀染是至關重要的，表 4.10 和表 4.11 的作者均采用去離子水，但作者在 SDS 凝膠的銀染實驗中證明需要再用玻璃蒸餾器蒸餾 1~2 次，背景染色會明顯降低。要注意試劑純度，有聚合現象的甲醛、戊二醛不能使用。凝膠最好先照相，再干燥保存。
銀染方法還在不斷改進，主要是提高靈敏度、縮短染色時間和簡化操作。Berson 使用一個藍色程序，靈敏度比單用化學顯色方法增加 3~7 倍。Blum 等利用改進的銀染方法可在 ng 范圍內檢測植物蛋白、RNA 和 DNA，而且無背景色。Gmnzier 解決了大分子（3 MDa) 的可溶性和銀染色問題。Kirkeby 等最近提出了一種染色程序，只在乙醇-醋酸中預固定 10 分鐘，再在甲醛和戊二醛溶液中固定 5 分鐘，這樣就大大縮短了染色過程的時間。Heukeshoven 和作者在 SDS 電泳中所用的銀染色全過程只需 1.5~2 小時，實際上用于 SDS 電泳的銀染色方法也適用于常規聚丙烯酰胺凝膠電泳，靈敏度可達 1~5 ng。但對 SDS 電泳，檢測靈敏度可達 0.3 ng。最近，Swain 等提出一種新的染色程序，可以達到高分辨和無背景色的目的，這些程序將在 “SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳” 中介紹。
在酸性凝膠中進行組蛋白分離的銀染方法可參見 Rabilloud 等使用的程序。
如果用考馬斯亮藍染色不能檢測到蛋白帶，而背景十分清晰的情況下，可以再進行銀染色。Kmuse 用考馬斯亮藍染色并干燥后的凝膠再進行快速的銀染。
這個方法適用于等電聚焦，SDS 電泳等。
四、其他染色方法
苯胺黑（aniline black)又稱尼格洛辛（nig rosine), 分子式為 C38H27N3，在有些情況下也可用于蛋白染色。Lee 用水溶性的苯胺黑對面筋蛋白（gluten protein) 染色比用氨基黑染色更清晰。Coulson 等把它用于檢測免疫沉淀反應后的小麥內胚乳蛋白的染色有特殊的優點。Aragancillo 等的實驗認為在有些情況下，苯胺黑的染色靈敏度甚至優于氨基黑。
麗春紅S ( Ponceau S ) 也可用于聚丙烯酰胺凝膠染色，靈敏度為 1~2 μg。它有兩種形式：猩紅（jana scarlet ) 和酸紅（acid red )。Cousden 等認為應使用后一種比較合適。
快綠 FCF ( Fast Green FCF) 染色對聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白定量掃描特別有利。將凝膠浸泡在 1% 的快綠 FCF 溶液（用 7% 醋酸配制）中約 2 小時。用 7% 醋酸脫色，其線性關系在 150~200 μg 范圍內。而在同樣情況下使用氨基黑，其線性關系只在 1~3 μg。快綠 FCF 通常用于組蛋白的染色。Gilmore 等用氫氧化鈉從染色的蛋白上洗脫快綠，縮短了定量測定的時間，并且不需使用有毒的有機溶劑。Allen 等和 Wilson 也對快綠染色有過報道。
Dahlberg 等用 Stains-All ( l-ethyl-2-[3- [ ethyl naphto ( 1，2，d )-thiazolin-2-vlidine] -2-methyl-propenyl ]-naphtho (1，2，d)-thiazolium bromide ) 進行蛋白染色，這是一種光敏染料，染色和脫色時要避免見光，蛋白帶呈紅色。
大家所熟知的蛋白與2，4 -二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene ）的反應也能用于蛋白的檢測。將凝膠在暗處浸在 2.5% 的 2, 4-二硝基氟苯中約 16 小時，再用鹽酸脫色。用這個方法檢測牛血清蛋白比氨基黑 10B 靈敏。用此方法還可以直接測定 N 端的氨基酸殘基，因而可以得到蛋白質純度的信息。
五、一些蛋白的染色方法
1. 糖蛋白
糖蛋白可以通過蛋白或碳水化合物的染色來檢測。上述的蛋白染色方法如氨基黑 10B，快綠 FCF，考馬斯亮藍 R-250 都能用于電泳后檢測糖蛋白，還有一些方法是基于與糖的部分反應。過去常用的方法是利用品紅（fuchsin ) 的高碘酸-希夫氏試劑（periodic-Schiffs reagent ) 染色，簡稱 PAS 染色。Mathie 等改進了 PAS 染色方法，使染色強度在 2 小時內迅速增強，然后再在 8 小時緩慢增強，改進后的方法其靈敏度比原來高 2 倍。染色帶在 520 nm 掃描。不同的糖蛋白其峰的面積和含量的線性關系呈現不同的斜率。所以為了定量需要，要嚴格使用相應的標準曲線。Wardi 等和 Eckhardt 等也改進了 PAS 方法。前者可檢測至 2~3 μg 的糖蛋白，后者則可檢測到 40 ng 的糖蛋白。Alcian 藍（alcian blue ) 染色能用于酸性糖蛋白的檢測。
外源凝集素和碳水化合物的專一相互作用是檢測糖蛋白的一種溫和的方法。這種方法使用熒光素異硫氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate, FITC ) 標記外源凝集素。將凝膠在 pH 7.0 左右在室溫下浸 12 小時，用相同的緩沖液脫色。FITC 溶液能被重復使用 3 次。在 4℃，熒光蛋白帶至少能在紫外燈下可見一個月。靈敏度約為 100 ng，取決于與外源凝集素結合的碳水化合物。FITC-外源凝集素可以從市場上買到，也可以自己制備。由于基礎科學研究的需要和市場的興趣，關于糖蛋白的結構與功能的研究正受到人們的關注。而熒光標記糖化物的電泳分析是一個高分辨和靈敏的方法，Jackson 對此進行了專門的論述。用熒光方法從糖基檢測糖蛋白的方法參見 “熒光探針法”。
使用丹磺酰肼（dansyl-hydrazine) 的方法可以靈敏地檢測低至 40 ng 的碳水化合物。另一種百里酚-硫酸（thymol-sulfuric acid) 方法也具有類似的靈敏度。用熒光標記、放射性標記或酶聯反應都可以得到理想的靈敏度。但在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測糖蛋白最靈敏的方法還是銀染色。Dubray 用銀染色得到的靈敏度比 PAS 法高 60 倍，最低檢測量可低至 0.4 ng。
2. 磷蛋白
Green 等用陽離子碳化青（cationic carbocyanine) 作為磷蛋白的染料。這種染料可以在酸性介質中或有尿素存在時使用。染色后得到藍色的帶可用于掃描。
檢測磷蛋白最靈敏的方法是使用放射性標記 32P。但在此同時，脂類和核酸也會被標記，所以在電泳前還必須先分離除去，這是一個繁瑣的過程。
非放射性磷蛋白的測量方法是以釋放磷酸鹽的陷入（entrapment of liberated phosphate, ELP) 最為常用，它取決于在有氯化鈣時，蛋白質磷酸酯鍵的堿水解產生的不溶性磷酸鈣陷入在凝膠中，然后用甲基綠染色。1 nmol/L 的磷酸鹽便能給出亮綠的蛋白帶。Debmyne 改進的 ELP 方法是基于形成一個不溶性的羅丹明 β-磷鉬酸鹽（rhodamine β-phosphomolybdate)，靈敏度能增加 2~3 倍。雖然銀染色方法更靈敏，但是一些非磷蛋白也可能同時被染色。Dahlberg 和 Green 的 stains-all 方法可將磷蛋白染成藍色，非共軛蛋白染成紅色，但是這種方法的專一性不夠好，因為糖蛋白、DNA和 RNA 也能被染成藍色，且靈敏度低于 ELP 方法。用電泳轉移和對酸性磷蛋白的三價金屬螯合作用也可以檢測磷蛋白。
3. 脂蛋白
脂蛋白可以使用常規的染色方法。但為了區別于其他蛋白，通常在電泳前進行預染色。蘇丹黑 B (Sudan black B)是常用的染料。電泳后用蘇丹黑 B 染色可采用 Prat 的方法。盡管銀染色對脂蛋染色缺乏專一性，但它是最靈敏的。
Smejkal 等報道了一種雙染方法，先用染料（filipin) 在 37℃ 染色 5 分鐘，可檢測低至 20 ng 的低密度脂蛋白，隨后再進行考馬斯亮藍染色以檢測其他蛋白。這是一種發熒光的染料，靈敏度高，染色速度快，并且不會影響隨后的考馬斯亮藍染色，這樣便可在一塊凝膠上同時檢測脂蛋白和其他蛋白。
4. 血紅蛋白和其他含鐵蛋白
血紅蛋白，轉鐵蛋白和其他含鐵離子的蛋白能用多種方法檢測。Clarke 用含有聯苯胺和 0.2 ml 醋酸溶解在 100 ml 水中，再用 30% 過氧化氫處理，30 分鐘后出現藍帶。
4，7-二苯-1，10-菲咯啉（4，7-diphenyl-1,10-phenanthroline）是檢測含鐵蛋白的靈敏試劑。凝膠被浸在含有 0.01% 菲咯啉和 0.02% 醋酸鈉溶液中約 1~2 小時，加 0.1 ml 巰基醋酸鹽。幾分鐘后用 2% 醋酸淋洗凝膠。含鐵蛋白呈紅色帶。
用普魯士藍（Prussian blue) 反應檢測鐵蛋白的方法相當簡便。將凝膠浸在溶于 2% 鹽酸中的 2% 普魯士藍溶液中約 1 小時，然后用蒸餾水洗脫便可。
血紅蛋白和珠蛋白復合物的染色可以用聯苯胺、四甲基聯苯胺（如 tetramethylbenzidine ) 和孔雀綠（leucomalachite green) 染色。前二種染料有毒，且四甲基聯苯胺染色結果不能保存。孔雀綠染色雖靈敏度不如前者，但操作方便。將 1 g 孔雀綠溶解在 100 ml 冰醋酸和 150 ml 蒸餾水中和鋅粉一起煮沸，直至染液無色，保存在 4℃ 備用。將凝膠在染液中染 10 分鐘，再轉移到 2% 過氧化氫或硼酸鈉的飽和溶液中，直至顯示出蛋白帶為止。
5. 銅蛋白和其他蛋白
含銅蛋白可以用茜素藍S ( alizalin S ) 檢測，藍色的帶表示銅的存在。檢測含銅蛋白的另一種方法是將凝膠放在 0.2 mol/L 半胱氨酸中約 3 小時。接著再放在含有 0.1% 2，2'-奎寧酮（2，2'-bisquinoline）的冰醋酸中，品紅色表示有銅蛋白的存在。
Moens 等發展了一種檢測后葉激素運載蛋白（neurophysins) 的方法，這種方法是用醛縮品紅反應，可專門用于檢測高胱氨酸含量的蛋白。
6. 同工酶染色
由于同工酶譜的分析比蛋白電泳譜的分析要容易得多，且同工酶譜在基礎研究和農、林、牧、副、漁、醫、藥、食品分析中應用十分廣泛，所以是一種非常有用的檢測方法。
常規聚丙烯酰胺凝膠電泳的重要特點是在電泳過程中可以保持蛋白質的生物活性，包括酶活性，這就給常規聚丙烯酰胺凝膠電泳的同工酶檢測創造了最基本的條件。縱然如此還必須避免電泳過程中由于條件不適而產生的蛋白變性，所以要選擇合適的緩沖系統（包括 pH 和離子強度）；對熱敏感的酶在電泳過程中要使用冷卻系統；在結束電泳，關掉電源后，蛋白區帶容易擴散，所以必須盡可能快地進行同工酶的染色。
同工酶染色方法可以分為幾類：
(1) 經典的同工酶染色是將凝膠切成小塊，浸泡在合適的緩沖液中進行擴散洗脫。 酶反應后，可做酶活性的定量測定。這種方法適合大體積的樣品的分析。如果活性帶緊靠，則會影響分辨率。
(2) 在有些情況下，由于酶的催化反應使無色的物質化學轉換成有色物質，如羧基酯、酰胺和萘酚的磷酸酯它們可分別被作為底物檢測酯酶、酰胺酶和磷酸酶。有兩種方式進行化學轉換：一是將凝膠浸泡在含有底物和重氮鹽的溶液中染色；二是先將凝膠浸泡在底物緩沖溶液中，然后再轉移到重氮溶液中。前者稱為 "同步偶聯方法"（simultaneous coupling method )，后者稱為 “溫浴后-捕獲方法” （postincubation-capture method )。前一種方法較好，因為不容易擴散，并且不需要作再一次保溫。
(3) 底物或引物包含技術（substrate or primer inclusion technique)。有時大分子底物或引物很難進入凝膠，所以大分子底物與酶的反應只能在凝膠表面上進行。為了克服此問題，在灌注凝膠時可以將大分子底物配在凝膠中再進行電泳。電泳后將凝膠浸泡在合適 pH 的緩沖液中，對大分子底物染色。脫色后，有色的帶便是有酶活性的帶。使用這個技術有兩個重要的規則需要注意，即底物在電泳時必須不遷移，不降解。如果核酸被加在聚丙烯酰胺凝膠中，不會出現問題，因為能使蛋白質遷移的合適的凝膠濃度不能使核酸分子移動，所以用 DNA 和 RNA 作為底物使用這種技術可檢測核糖核酸酶或作為引物可檢測 DNA 聚合酶。
(4) 指示凝膠技術（indicator gel technique)。這個技術可用于醋酸纖維素膜電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果必須使用大分子底物檢測酶活性，可在電泳后使用含有底物的指示膠。在合適的緩沖液及輔助因子中和分離膠的兩個表面接觸，保溫這個 “三明治”，再對分離膠中的酶染色，這個方法使酶帶的位置接觸染色。指示膠通常由淀粉或瓊脂組成，有時還可以用濾紙，很少用聚丙烯酰胺。這個技術也可用于與低分子質量底物結合的酶的檢測。
(5) 在有的情況下酶的檢測要通過一個輔助酶的轉換而產生顏色。在電泳后檢測酶時，酶催化反應介質的 pH 是非常重要的。如果電泳是在遠離合適酶反應的 pH 完成的。那么在檢測前應將酶放在合適 pH 的冷的緩沖液中，用凝膠掃描儀掃描同工酶譜，其吸收峰面積即表示酶的活性。也可以在緩沖液中洗脫酶帶，再在分光光度計上測量酶活性。后者方法麻煩，且不準確。
經典方法測量酶活性，其酶的量是一個限定因子。在凝膠中測定酶活性，底物必須擴散到凝膠中。底物進入凝膠的比例決定了底物的濃度。如果在保溫混合液中，底物濃度逐漸減少，則進入凝膠的底物也會逐漸減少。為了避免這種情況，必須使用大體積的反應混合液。底物的轉換開始于底物和酶的接觸。在凝膠中某一點底物的濃度決定于底物的比例和酶反應的速率。沒有反應的底物分子進入凝膠的深層，由于高酶濃度的影響，它們將很快的轉換，所以底物不僅能從凝膠表面直接垂直地和酶帶接觸，而且能從帶的側面接觸。而且酶分子可以在保溫時被固定，但也可能在保溫時擴散出來，其結果可能在酶帶的周圍形成一個邊緣。這種邊緣的形成會引起掃描時的誤差，所以酶譜的定量測定不像一般蛋白譜，必須謹慎。當然大部分情況下，電泳帶中的酶的含量與峰的面積是有線性關系的。
Fritz 等在實驗中觀察乳酸脫氫酶同工酶的量決定于電泳時所加的蛋白量。但是用電泳方法測量的比例和用其他方法得到的結果不同。在聚丙烯酰胺凝膠中，小量的酶顯示了相對較高的酶活性，這可能是由于底物和偶聯試劑進入較慢。Gremer 等在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶的實驗中卻沒有觀察到這種現象，這可能是因為底物、輔酶和偶聯試劑等很快進入凝膠的原因。
脫氫酶類的染色通常是將凝膠浸泡在作為最終電子受體的四唑（鎓）鹽 ( tetrazolium salt ) 溶液中，如硝基藍四唑鎓（nitroblue tetrazolium, NBT), 甲基噻唑四唑鎓（methyl thiazolyl tetrazolim, MTT) 或別的合適的四唑鎓鹽而被還原產生有色的甲噆（formazan)。吩嗪硫酸甲醋（phenazine methosulfate, PMS) 有時被作為還原輔酶或酶取代基和四唑鎓之間的氫化物離子載體。因為四唑鎓鹽是光敏的，所以需要在暗室中保溫。
水解酶類常常采用在酶反應后能產生顏色或發熒光的產物即具有生色團或熒光團的物質來檢測。轉移酶類和同分異構酶類不能使用這個方法，通常同時需要一個偶聯酶，以檢測其混合物。由于偶聯酶很難進入聚丙烯酰胺凝膠，僅能在凝膠表面產生顏色，常常用瓊脂糖、瓊脂或聚酯膜鋪在聚丙烯酰胺凝膠表面來完成反應。
現在酶染色已使用丁子香酚（eugenol) 和四羧酸鹽（tetmbase) 來替代有潛在危險的致癌試劑，如聯苯胺和 O-聯茴香胺（O-dianisidine)。并且越來越普遍的是使用熒光標記物質，如傘形化合物（umbelliferyl) 或丹磺酰衍生物。
有關同工酶的文章和出版物很多。早在 1970 年 Shaw 等便列示了各種同工酶的染色配方。以后 Harris 和 Hopkinson 也給出了同工酶的染色方法，并且逐年不斷增補。有時一種酶可以有幾種不同的染色方法。且用于淀粉凝膠的方法可同樣用于聚丙烯酰胺凝膠。Rothe 等和 Heeb 等對聚丙烯酰胺凝膠同工酶的染色方法進行了綜述。Gaa 等在書中詳述了各類同工酶，包括脫氫酶類、過氧化物酶類、轉移酶類、還原酶類、水解酶類、磷酸酶類、多肽酶類、蛋白酶類和裂解酶類的染色原理和方法。Homes 等則列示了近二百種同工酶染色方法的文獻。
作者利用同工酶染色的技術曾檢測不同種魚、羊、蜜蜂的各種同工酶，以對它們的分類，遺傳變異進行研究。同時利用不同類型化合物對酯酶同工酶活性的抑制程度研究藥物的毒理作用和尋找棉鈴蟲和煙青蟲的種群分化及遺傳關系。在法醫學研究方面，利用酯酶 D 和酸性磷酸酶對人血清進行快速分型。
有關同工酶染色的技術仍在不斷發展。Vargiec 等在變性或不變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用 α-萘吡喃葡萄糖苷（α-naphthylglucopyranoside) 作底物，酶反應得到的 α-萘酚用快紅B ( fast red B ) 或快藍 BB ( fast blue BB ) 染色，快速而簡單地測定了外-β-1，3-葡聚糖酶（exo-β-1，3-glucanase) 的活性。Kalix 等用含有底物羧甲基-curdlan [一種和染料 Remazol 亮藍（RBB )交聯的多糖 ] 的凝膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后便可直接得到植物萃取液中多個 β-1，3-葡聚糖酶同工酶帶的相對定位，并可同時測定酶活性。β-葡聚糖降解同工酶（β-glucan degrading isozymes) 是大麥中 β-葡聚糖水解的專一酶。對其多型性可用含有 β-葡聚糖（β-glucan) 或地衣多糖（lichenan) 的凝膠電泳后，用剛果紅（Congo red) 染色便可得到清晰的同工酶帶。利用葡萄糖、果糖、甘露糖和葡萄糖-1-磷酸鹽的釋放活性，可在電泳后檢測糖苷酶和糖基轉移酶。
甘氨酸-N-甲基轉移酶（glycine-N-methyl transferase) 是大量存在于哺乳動物肝臟中的一種蛋白。Santos 介紹了一種專一的酶譜檢測方法。這是通過甘氨酸的甲基化作用產生的肌氨酸來檢測的。
peyronel 等用偶氮酪蛋白（azocasein) 在電泳后檢測蛋白酶，方法十分簡單快捷。電泳后將凝膠保溫在有三氯醋酸的偶氮酪蛋白溶液中，再用氫氧化鈉處理，便可在橙色背景上得到無色的帶。凝膠可在三氯醋酸中保存幾個月。這個技術對絲氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶和金屬蛋白酶的檢測可以得到很好的結果。甚至可在 SDS 電泳后檢測。靈敏度可達亞微克量水平。
King 等詳細地給出了得到高分辨率瓜氨酸同工酶的各種電泳條件，包括緩沖系統、凝膠配制、樣品萃取、電泳條件和定性、定量檢測方法。
Alonso 等用釕紅（ruthenium red) 在 20 分鐘~1 小時簡便并靈敏地檢測果膠酯酶（pectin esterase)。作者等用發熒光的傘形化合物檢測了人血紅蛋白中的酯酶 D 和酸性磷酸酶。Karesen 等通過酯酶和蘋果酸脫氫酸的分析來辨別土豆中的胞囊（cast) 和根-團-線蟲（root-knot-nematodes)。
堿性核糖核酸酶的檢測可以將含有底物 RNA 和溴化乙錠（ethidium bromide) 的瓊脂糖干膜覆蓋在凝膠上進行。靈敏度可達 0.5 ng，并可同時進行核糖核酸酶的抑制實驗，Randeniya 用酶染和免疫方法檢測了松柏醇氧化酶 (coniferylalcohol exidase) 和等電點約為 9 的漆酶（laccases)。
Aledo 等對膜蛋白在兩種不同系統（Triton X-100 和 CHAPS) 中進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，基于谷氨酰胺酶的活性用新的方法檢測了膜蛋白中的酶的存在，最小檢測量為 1~5 μg 的 PAG ( phosphate-activated glutaminase) 活性。
同工酶染色方法適用于各種電泳，包括常規聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦、滴定曲線，有時甚至還適用于 SDS 電泳。
七、熒光探針法
與同位素標記的放射性檢測方法相比，熒光探針方法雖然在靈敏度上稍有遜色，但它標記時不需要合成，檢測手段方便，更沒有放射性的危險，所以蛋白質檢測，甚至核酸檢測都盡可能避免使用放射性方法。如核酸定序過去都采用放射自顯影方法，而現在則采用激光熒光方法便是實例。
熒光探針實際上也是一種蛋白染色，其特點是染料本身或反應產物在一定環境中必須是發熒光的。熒光探針方法可分為電泳前預標記和電泳后再標記兩種方法。電泳前預標記蛋白的方法最早使用的熒光探劑是丹磺酰氯（dansyl chlride），后來用的比較多的是熒光胺（fluorescamine)，全稱是 [ 4-phenyl-spiro [ furan-2（3 H），1-phthalan ]-3，3'-dione ]。因為游離的熒光胺和它的水解產物都不發熒光，只有當它結合到蛋白質上時才發熒光，這樣就不會有熒光背景的問題，所以它最主要的優點是檢測靈敏度高，約 5 ng 的蛋白便可在暗室中用紫外燈檢測。它的缺點是當它和蛋白質發生反應時，它會轉換一個氨基到羧基上，所以會改變蛋白在常規聚丙烯酰胺凝膠電泳和 SDS 電泳中的遷移率。雖然也有作者觀察到此蛋白的遷移率 Rf 和以 10 為底的分子質量的對數仍然有線性 關系。
熒光探劑 MDPF，全稱 2-甲氧基-2,4-二苯-3(2H)-呋喃 [ 2-methoxy-2,4-diphenyl-3( 2H)-furanone] 的優點是被標記蛋白的熒光在聚丙烯酰胺凝膠中能保持幾個月，但熒光胺只能保持 24 小時。使用 MDPF 作探劑時，蛋白的遷移率和分子質量的對數之間的線性關系在 1~500 ng 范圍內。DACM 即 N-(7-二甲基胺-4-甲基香豆素）馬來酰亞胺 [ N-(7-dimethylamino-4-methyl-coumariny) maleimide ]和 OPA 即鄰苯二甲酸二酸（O-phthaldialdehyde) 也可作為蛋白的預熒光標記的探劑。OPA 的靈敏度比熒光胺高 10 倍。
OPA 和熒光胺也可用于電泳后的蛋白熒光標記。OPA 和 ANS，( 1-苯胺-8-萘碘酸鹽，l-aniline-8-naphthalene sulphonate) 可用于制備凝膠電泳后蛋白帶的迅速定位。使用 OPA 作熒光探劑的簡單方法是將電泳的凝膠浸泡在 β-巰基乙醇溶液（100 ml 0.1 mol/L pH8.5 巴比妥鈉緩沖液或磷酸緩沖液含 70~80 μl β-巰基乙醇）中約 10~25 分鐘。在 OPA 溶液（在 2 ml 甲醇中加 20 mg OPA ) 中暗環境放置 15 分鐘便可用紫外燈在 365 nm 觀察熒光帶。使用 ANS 的簡便方法是將凝膠浸在 0.003% ( W/V）ANS/0.1 mol/L pH6.8 磷酸緩沖液中約 5~10 分鐘便可在紫外燈下觀察熒光帶。但是這種方法不靈敏，大于 20 μg 的蛋白才能呈現熒光。
Bis-ANS, 全稱 [ 雙（8-對-甲苯氨基-1-萘碘酸鹽）]，[ bis ( 8-p-toluidino-1-naphthalene sulphonate )] 已被報道在 SDS 電泳后用于檢測比 ANS 靈敏，特別是當有陽離子（如氯化鉀）存在時，0.5 μg 網蛋白便能被檢測到。OPA 則更靈敏，約 0.25 μg 的蛋白便能在紫外燈下見到，且大部分酶的活性仍被保持。
利用熒光淬滅的原理也能靈敏地檢測蛋白帶。有時電泳后用紫外燈也可以直接觀察到蛋白帶而不需要加任何探劑，但只有富含色氨酸的蛋白才能進行熒光的直接觀察。
正如 “同工酶染色” 所述，目前在同工酶染色中使用熒光標記越來越普遍。作者等即是用發熒光的四甲基傘形化合物的磷酸鹽和醋酸
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