M13噬菌體衣殼蛋白改造在改良噬菌體展示技術的應用實驗

羧芐青霉素氯霉素大腸桿菌 CJ236

生理磷酸緩沖液超純甘油PBS-T 緩沖液PBS-T-BSA 緩沖液

2YT 培養基SOC 培養基

下述方法描述了 P8 庫的設計（見 12.3.1)、構建（見 12.3.2 )、選擇（見 12.3.3.1 ) 和篩選（見 12.3.3.2)，依此來鑒定能改進蛋白質表達水平的突變體。我們描述了利用前述噬菌粒—— pS1607 改進 hGH 表達水平的方案。這一方法也適用于任何其他靶蛋白。唯一的改變就是用表達靶蛋白的噬菌體粒取代 pS1607 以及用高親和性
的靶蛋白配體取代 hGH 結合蛋白。

3.1 庫的設計

我們前面已經提及在噬菌粒表達系統中 P8 的 N 端部分極度耐受突變，其中有些突變能增加異源融合蛋白的展示水平 [ 10，11 ]。隨后，我們發現 P8 的 N 端只有 6 個野生型殘基側鏈（Ala 7、Ala 9、Ala 10、Phe11、Leu14 和 Ala18 ) 對 P8 有效包裝到噬菌體外殼是必需的 [ 10，12 ]。這些側鏈形成一個緊密的疏水抗原決定簇（圖 12.1)，在噬菌體組裝過程中起到關鍵作用。環繞這一決定簇的殘基突變能增加包裝效率，從而增加異源蛋白
的展示水平 [ 10 ]。基于這些研究，我們鑒定出了 7 個位點（Pro 6、Lys 8、Asn12、Ser13、Gln15、Ala16 和 Ser17)，這些位點的突變最可能改進蛋白質展示水平（圖 12.1)。蛋白質內 7 個位點的完全隨機化能導致接近 10⁹ 的獨特氨基酸組合，這一多樣性能夠被這里所描述的制備庫的約 10¹⁰ 的多樣性所覆蓋。



3.2 庫的構建

P8 變異庫用前述寡核苷酸誘導突變法的優化版本 [2] 來構建。首先，一條突變的寡核苷酸（序列：GTAATAATAAGCGACCGAATATATC) 用于在隨機化位點引入終止密碼子；12.3.2.2 節中提供的寡核苷酸誘導的位點特異的突變方案可以用于小規模突變來引入終止密碼子（見注 1 )。終止密碼子的引入消除了野生型蛋白的表達，所以 “終止模板” 噬菌粒可以作為模板用來建庫。含尿嘧啶的單鏈 DNA 終止模板（從宿主中純化的）和突變寡核苷酸（序列：GCCGAGGGTGACGATNNKGCATAAGCGGCCTTTNNKNNKCTGNNKNNKNNKGCGACCGAATATATC ) 進行退火，這樣就能用編碼 20 種氨基酸的 NNK ( N = A/G/C/T，各 25%；K = G/T，各 50% )
取代終止密碼子。突變寡核苷酸鏈作為引物合成一條互補的 DNA 鏈，最終形成一個共價閉環雙鏈異質 DNA (CCC-dsDNA)。建庫完成后，CCC-dsDNA 通過電轉化法引入宿主中，在宿主中錯配按照野生序列或突變序列進行修復。在 ung⁺ 菌株中，dU 模板鏈傾向于失活，而合成的突變鏈被增殖，這樣就實現了有效突變（大
于 50% )。用隨機化位點均為終止密碼子的序列做模板保證了只有完全突變的克隆才含有可讀框，才能在噬菌體表面展示。與輔助噬菌體一起轉化宿主大腸桿菌，庫里的各成員就能包裝進噬菌體顆粒。

3.2.1 純化 dU-ssDNA 模板

突變效率依賴模板的純度，因此高純度 dU-ssDNA 的應用對庫的成功構建至關重要。我們用 Qiagen QIAprep  Spin  M13 Kit 來純化 dU-ssDNA，下面就是 Qiagen 方案的一個修改版。對一個中等拷貝的噬菌粒而言（如 PS1607，其包含 pBR322 的骨架），這個方案至少能獲得 20 μg 的 dU-ssDNA，這足以滿足建庫的需要（見注 2)。

( 1 ) 從新鮮的 LB/抗菌素板上挑出一個含有某噬菌粒的 E.coli CJ236 ( 或者其他 dut^- / ung^- ) 菌株的單克隆放入 1 ml 2YT 加有 M13KO7 helper 噬菌體（10¹⁰ pfu/ml ) 和相應抗菌素的培養基中以保持宿主 F' 附加體和噬菌粒。例如，2YT/Carb/cmp 培養基中含有羧芐青霉素來選擇帶有內酰胺酶基因的噬菌粒，而氯霉素用來選擇 CJ236
F' 附加體。37°C 及 200 r/min 下搖動 2 h 并且加入卡那霉素（25 μg/ml ) 來選擇被 M13KO7 共轉染的帶有卡那霉素抗性基因的克隆。在 37°C 及 200 r/min 下搖動 6 h 后，轉移培養到 30 ml 的 2YT/carb/kan/uridine 培養基。再在 37°C 及 200 r/min 下搖動過夜。

( 2 ) 在 4°C 27000 g 下（15000 r/min 在 Sorvall SS-34 轉子中）離心 10 min。轉移上清液到含有 1/5 體積 PEG/NaCl 的新試管中，室溫孵育 5 min。在 4°C 12000 g 下 ( 10000 r/min 在 Sorvall SS-34 轉子中）離心 10 min。移走上清液，在 2000 g ( 4000 r/min) 下短暫離心，吸出殘余上清液。

( 3 ) 在 0.5 ml 的 PBS 中重新懸浮起噬菌體沉淀小團，轉移到一個新的 EP 離心管中。在桌式小離心機中用 14000 g 離心 5 min，轉移上清液到新的 EP 離心管中。

( 4 ) 加入 7.0 μl MP 緩沖液（Qiagen) ，混勻。室溫孵育至少 2 min。

( 5 ) 在 2 ml 小離心試管的 QIAprep spin column（離心層析柱，Qiagen）中加入上述樣品。在桌式小離心機中 6000 g 離心 30s。遺棄流出液。噬菌體顆粒仍然結合在層析柱介質中。

( 6 ) 在柱中加入 0.7 ml 的 MLB 緩沖液（Qiagen)。6000 g 離心 30s，棄流出液。

( 7 ) 在柱中再加入 0.7 ml 的 MLB 緩沖液。室溫孵育至少 1 min。6000 g 離心 30s。棄流出液。噬菌體 DNA 與殼蛋白分離，仍然吸附在層析柱介質中。

( 8 ) 加入 0.7 ml 的 PE 緩沖液（Qiagen)。6000 g 離心 30s，棄流出液。

( 9 ) 重復步驟（8 )，去除殘余的蛋白質及鹽。

( 10 ) 6000 g 離心 30s，將小層析柱轉移到一個新的 1.5 ml EP 離心試管中。

( 11 ) 加入 100 μl 的 EB 緩沖液（Qiagen: 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5 ) 到層析柱膜的中心部位。室溫孵育 10 min，然后 6000 g 離心 30s。保存流出液，其中包含純化的 dU-ssDNA。

( 12 ) 分析上述 DNA，用 1.0 μl DNA 溶液進行 TAE 瓊脂糖凝膠電泳。結果 DNA 應該是明顯的單一條帶，但是也經常可以觀察到一些較低電泳遷移率的弱帶（見圖 12.2 中泳道 2 )。這些弱帶很可能是由于 ssDNA 的二級結構所致。

( 13 ) 利用 260 nm 的吸收值（A₂₆₀ = 1.0 相應于 33 ng/μl 單鏈 DNA ) 測定 DNA 濃度。典型 DNA 濃度范圍應該為 200~500 ng/μl。

3.2.2 體外合成異源雙鏈 CCC-dsDNA

用 dU-ssDNA 作為模板，經過三步程序就能把突變寡核苷酸包裝到異源 CCC-dsDNA 內。這里描述的方案是前述方法的改進和規模擴大化的版本 [13] 。寡核苷酸先進行 5' 磷酸化，然后和 dU-ssDNA 模板退火。寡核苷酸鏈通過延伸和連接形成異源 CCC-dsDNA ( 圖 12.2 中泳道 3 )，然后再進行純化和脫鹽。這一方案能獲得大約 20 μg 高純度、低電導率的 CCC-dsDNA。這足以構建容量超過 10¹⁰ 的庫（見注 3)。



1 ) 用 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化寡核苷酸

( 1 ) 在 1.5 ml EP 離心管中混合加入 0.6 μg 突變寡核苷酸、2.0 μl 的 10X TM 緩沖液、2.0 μl 的 10 mmol/L  ATP 和 1.0 μl 的 100 mmol/L DTT。加水到總體積為 20 μl。

( 2 ) 往上述體系中加入 20U 的 T4 聚核苷酸激酶。37°C 孵育 1 h (見注4)。

2 ) 寡核苷酸和模板一起退火

( 1 ) 在 20 μl 磷酸化反應混合物中加入 20 μg 的 dU-ssDNA 模板（來自 12.3.2.1 ) 、25 μl 的 10 X TM 緩沖液，加水到總體積為 250 μl。假設寡核苷酸與模板長度比是 1:100，上述 DNA 的量給出寡核苷酸與模板摩爾比為 3:1。

( 2 ) 90°C 孵育 3 min、50°C 孵育 3 min、20°C 孵育 5 min ( 見注 5)。

3 ) 合成 CCC-dsDNA

( 1 ) 在已經退火的寡核苷酸與模板混合物中加入 10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 25 mmol/L 的 dNTP、15 μl 100 mmol/L DTT、30 Weiss U 的 T4 DNA 連接酶以及 30U 的 T7 DNA 聚合酶。

( 2 ) 20°C 孵育過夜。

( 3 ) 利用 Qiagen QIAquick DNA 純化試劑盒，對上述 DNA 進行親和純化及脫鹽。加入 1.0 ml 的 QG (Qiagen) 緩沖液混合。

( 4 ) 將上述樣品放入兩個置于 2 ml 離心試管中的 QIAquick spin 離心層析柱。在桌式小離心機中用 14000 g 離 心 1 min，去除流過液。

( 5 ) 在每個柱子中加入 750 μl 的 PE 緩沖液（Qiagen)。14000 g 離心 1 min。去除流過液，再 13000 r/min 離 心 1 min。將層析柱置于新的 1.5 ml EP 小離心管。

( 6 ) 在層析柱膜的中心部位加入 35 μl 的 USP 超純水。室溫孵育 2 min ( 見注 6)。

( 7 ) 14000 g 離心 1 min 洗提出 DNA。混合兩個管中的洗提液。得到的 DNA 可以立即進行大腸桿菌電轉化實驗，也可凍存以備后用。

( 8 ) 同時與 dU-ssDNA 模板電泳 1.0 μl 的上述洗提出的反應產物。用含有溴化乙錠（EB ) 的 TAE 瓊脂糖凝膠電泳來檢測 DNA ( 圖 12.2 及注 7 )。

一個成功的反應能使 dU-ssDNA 完全轉化成低電泳遷移率的 dsDNA。通常，至少能看到兩條產物帶并且不存在dU-ssDNA ( 圖 12.2) 。 其中電泳遷移率較高的帶就是所需的產物——正確延伸和連接的 CCC-dsDNA，可以用于有效轉化大腸桿菌并且提供較高突變效率（約 80% )。而電遷移率較低的帶是由 T7 DNA 聚合酶星號活性所致的單鏈異常產物 [14]，其突變率較低（約 20% )，轉化效率也只有 CCC-dsDNA 的 1/30。如果 ssDNA 模板的重要部分轉化為 CCC-dsDNA，那么就能得到一個高突變、高多樣性的庫。有時能得到電遷移率介于前述二者之間的第 3 條帶，這條帶被正確延伸但是沒有連接的 dsDNA ( 圖 12.2) 。產生這一條帶的原因要么是 T4 DNA 連接酶活性不夠，要么就是寡核苷酸磷酸化不完全。

3.2.3 大腸桿菌電穿孔和噬菌體擴增

要完成庫構建，異源 CCC-dsDNA 還必須引入含有 F' 附加體的大腸桿菌宿主中。M13 噬菌體能侵染這種宿主并在其中增殖。噬菌體展示庫的多樣性還受限于 DNA 引入大腸桿菌的方法，其中高壓電轉化法的效率最高。

我們構建了一個大腸桿菌菌株——SS320，這是高效電轉化和噬菌體增殖的理想菌株 [2]。用標準的噬菌體雜交方案 [ 15 ]，我們將 F' 附加體從 E.coli XL-1 Blue (Stmtagene) 轉入 E.coli MC1061 (Bio-Rad)。E.coli MC1061 的染色體標記有鏈霉素抗性，而 E.coli XL-1 Blue 的附加體含有四環素抗性，這樣雜交產生的子代菌株可以通過鏈霉素和四環素雙抗進行選擇。E.coli SS320 保留了 E.coli MC1061 的高電轉化效率，同時 F' 附加體的存在使得 M13 噬菌體感染宿主成為可能。

( 1 ) 將上述純化好的 DNA ( 來自 3 )，約 20 μg 置于最小體積）及 0.2 cm 間隙的電轉槽置于冰上冷卻。在冰上融化 350 μl 分裝好的電轉感受態 E.coli SS320 細胞。將感受態細胞加入 DNA 中且用移液槍吸放數次混合（避免產生氣泡）。

( 2 ) 轉移混合物于電轉槽中進行電穿孔轉化。電穿孔轉化操作時，應遵循儀器廠家的指導手冊，建議使用 BTX ECM-600 電轉化儀時應設置：場強 2.5kV，電阻 129Ω，電容 50 μF。也可以使用 BioRad 的 Gene Pulser 電轉化儀及如下設置：場強 2.5kV，電阻 200 Ω，電容 25 μF。

( 3 ) 立即在電穿孔轉化后的電轉槽中加入 1 ml SOC 培養基以營救這些細胞并且轉移培養基到一個 250 ml 的錐形瓶中。用 1 ml SOC 培養基沖洗電轉槽兩次。再向瓶中加入 SOC 培養基到終體積為 25 ml，在 200 r/min 搖 床 37°C 孵育 20 min。

( 4 ) 要確定所建庫的多樣性，可以在 LB/carb 培養皿中系列稀釋涂板來選擇適當的噬菌粒（如帶有 β-內酰胺酶基因的噬菌粒 pS1607)。

( 5 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌體（4 X 10¹⁰ pfu/ml)，在 200 r/min 搖床 37°C 孵育 10 min。

( 6 ) 轉移培養液于含有 500 ml 2YT 培養基的 2 L 錐形瓶中，加入合適的抗生素進行噬菌粒選擇（如 2YT/carb 培養基）。

( 7 ) 在 200 r/min 搖床 37°C 孵育 1 h 且加入 25 μg/ml 的卡那霉素。然后在 200 r/min 搖動下 37°C 孵育過夜。

( 8 ) 將上述培養液在 4°C 及 16000 g 下（10000 r/min 在 Sorvall GSA 轉子中）離心 10 min。轉移上清液到含有 1/5 體積 PEG/NaCl 的新試管中以沉淀噬菌體。室溫孵育 5 min。

( 9 ) 在 Sotvall GSA 轉子中 4°C 及 16000 g 下離心 10 min。去除上清液。再簡短離心一下，用移液管吸走上清液殘余。重新懸浮噬菌體小團于 1/20 體積的 PBS 中。

( 10 ) 在 4°C 及 27000 g 下（在 Sorvall SS-34 轉子中，15000 r/min) 離心 5 min 以去除不溶性雜質。轉移上清液于一個干凈試管。

( 11 ) 利用分光光度計估計噬菌體濃度（268 nm 的光密度 [OD₂₆₈]  = 1.0 時溶液中噬菌體濃度約為 5 X 10¹² 噬菌體/ml；見注 8）。

3.2.4 制備 E.coli SS320 電穿孔法感受態

下述方案能產生大約 12 ml 高濃度 E.coli SS320 電穿孔法感受態（約 3 X 10¹¹ cfn/ml )。細胞可以長期儲存于 -70°C。

( 1 ) 在 1 ml 的 2YT/tet 培養基中接種一個生長于新鮮 LB/tet 培養皿的 E.coli SS320 菌株單克隆。在 200 r/min 搖床 37°C 孵育 6~8 h。

( 2 ) 轉移培養液于有 500 ml 的 2YT/tet 培養基的 2 L 錐形瓶中，在 200 r/min 搖動下 37°C 孵育過夜。

( 3 ) 用 5 ml 上述過夜培養液接種 6 個 2 L 錐形瓶，每瓶含有 900 ml 的 Superbroth/tet 培養基（見 12.2.1.4)。在 200 r/min 搖動下 37°C 孵育到 OD₅₅₀ 約為 0.8。

( 4 ) 在冰上冷卻 3 個上述錐形瓶 5 min，不時搖動。下列步驟（5 )~（12 ) 應該在冷室中及冰上進行，所用一切溶液及儀器應該預冷。

( 5 ) 在 Sorvall GS-3 轉子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下離心 10 min。去除上清液然后從其他 3 個瓶中加入余下的培養液（所有液體需要預冷）。重復上述離心及去除上清液步驟。

( 6 ) 在離心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4，同時加入滅菌的磁鐵攪拌棒來幫助重懸離心沉淀的細胞。搖動使沉淀脫離管壁，并且在適中的速度下磁力攪拌以完全重懸細胞沉淀。

( 7 ) 在 Sorvall GS-3 轉子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下離心 10 min。去除上清液，小心管中的磁鐵攪拌棒。從轉子中取出離心管時要小心保持離心管的位置以避免干擾管底的細胞沉淀。

( 8 ) 在離心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4。重懸細胞沉淀，重復步驟（6 ) 和（7 ) 中的重懸及離心過程。去除上清液。

( 9 ) 重懸每管細胞沉淀于 150 ml 的 10% 超純甘油中。不要混合各離心管。

( 10 ) 在 Sorvall GS-3 轉子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下離心 15 min。去除上清液并且取出磁鐵攪拌棒。用一個移液管小心吸出殘余的上清液。

( 11 ) 在一個離心管中加入 3.0 ml 的 10% 超純甘油，用（移液管）小心抽吸重懸細胞沉淀。轉移懸浮好的細胞到另一個離心管，重復上述過程直到所有細胞沉淀都得到很好地懸浮。

( 12 ) 在液氮中快速冰凍分裝為 350 μl 的感受態細胞并且儲存于 -70°C。

3.3 選擇和分析能提高融合蛋白展示水平的 P8 變異體

3.3.1 從 hGH-P8 庫中選擇噬菌體

將 hGHbp 包被于 96 孔 Maxisorp 免疫板上作為誘餌，上述 hGH-P8 庫中的噬菌體通過多輪結合實驗進行篩選 [16]。在 M13KO7 輔助噬菌體的幫助下，噬菌體在 XL-1 Blue 中進行增殖以備后續篩選之用。

1 ) 用靶蛋白包被 96 孔 Maxisorp 板

( 1 ) 用 100 μl 5 μg/ml 的靶蛋白（如 hGHbp) 溶液包被 96 孔 Maxisorp 板中的 8 孔，4°C 孵育過夜。直接傾倒 96 孔板于水池，以去除孔中溶液。

( 2 ) 在每孔中加入 200 μl 0.2% 溶于 PBS 的 BSA 溶液以阻止其他蛋白質對 Maxisorp 板的非特異性結合，室溫下搖動 1 h。

2 ) 噬菌體庫的選擇

( 1 ) 在上述每孔中加入一定量的置于 PBS-T-BSA 緩沖液中的噬菌體庫（約 10¹² phage/ml)。在室溫下搖動 2 h 。然后用 PBS-T 緩沖液洗 96 孔 Maxisorp 板 8 次。結合篩選的嚴厲性（stringency) 可以在以后的篩選中通過增加洗滌的次數來調控。

( 2 ) 在每孔中加入 100 μl 的 100 mmol/L HCl 以洗脫結合的噬菌體。在室溫下強力搖動 5 min。

( 3 ) 將所有洗脫液收集到一起，加入 1/5 體積的 1.0 mol/L Tris-堿中和。

3 ) 增殖噬菌體以備后用

( 1 ) 將上述洗脫出的噬菌體混合液加入到 10 倍體積的 XL-1 Blue 細胞中（OD₅₅₀ =0.5~1.0 ) 。

( 2 ) 37℃ 下 200 r/min 搖動孵育 20 min，取出 10 μl 留備測量滴度，參考 12.3.2.3 節中步驟（4 ) 。

( 3 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌體，在 200 r/min 搖床 37°C 孵育 45 min。

( 4 ) 轉移培養液于 100 ml 的 2YT/carb/kan 培養基中，在 200 r/min，37°C 下搖動過夜。

( 5 ) 利用 PEG/NaCl 沉淀法分離噬菌體，參照 12.3.2.3 節，步驟（8 ) ~（10)。

( 6 ) 重復上述篩選過程 5 次，每輪只用一半的洗脫噬菌體。

3.3.2 噬菌體酶聯免疫法測定 hGH 展示水平

在 hGH 展示選擇后（見 12.3.3.1)，通過酶聯免疫法 [ 2，11 ] 可以測定單個克隆的 hGH 相對于 P8 的展示水平。順次稀釋的 hGH- P8 噬菌體溶液在含固定化 hGHbp 誘餌的板上孵育。洗去未結合的噬菌體，結合的噬菌體經過辣根過氧化物酶偶聯的 M13 抗體反應后可以通過光譜學進行檢測。從噬菌體濃度對 450 nm 吸收值曲線上，通過比較噬菌體濃度和特定吸收值關系，可以估計出 P8 變異體較野生型 P8 對 hGH 展示水平提高的程度 [11] 。hGH 展示水平高的克隆被送去測定其 DNA 序列，進而推斷出融合有 hGH 的 P8 變異體的序列。

( 1 ) 從新鮮的 LB/tet 板上挑出一個含有特定噬菌粒的 E.coli XL-1 Blue 菌株的單克隆，放入 1 ml 加有 M13KO7 helper 噬菌體（10¹⁰pfu/ml ) 和 50 μg/ml 羧芐青霉素（以保持噬菌體）及 5 μg/ml 四環素（以保持 F' 附加體）的 2YT 培養基中。在 200 r/min，37°C 下搖動 2 h，再加入 25 μg/ml 的卡那霉素來選擇共轉染了 M13KO7 的克隆。再在 200 r/min，37°C 下搖動 6 h，轉移培養液于 30 ml 2YT/carb/kan 培養基中。在 200 r/min，37°C 下搖動過夜。

( 2 ) 在 4°C 及 27000 g 下（Sorvall SS-34 轉子中，15000 r/min) 離心 10 min。轉移上清液于一個含有 1/5 體 積 PEG/NaCl 的干凈試管中，室溫孵育 5 min。在 4°C 及 12000 g 下（10000 r/min，Sorvall SS-34 轉子中）離心 10 min。去除上清液。在 2000 g ( 4000 r/min) 簡短離心一下，再用移液管吸走上清液殘余。

( 3 ) 重懸噬菌體沉淀小團于 0.5 ml 的 PBS-T-BSA 緩沖液中，將其轉移到一個 1.5 ml 的 EP 離心管中。在桌式離心機中用 14000 g 離心 5 min，再轉移上清液到一個新的 1.5 ml EP 離心管中。

( 4 ) 利用分光光度計法估計噬菌體濃度。

( 5 ) 用 PBS-T-BSA 緩沖液準備 5 倍系列稀釋的噬菌體儲液。 

( 6 ) 轉移 100 μl 的噬菌體溶液到有 hGHbp 包被且 BSA 封閉的 96 孔 Maxisorp 免疫板（見 12.3.3.1 中 1))。溫和搖動孵育 1 h。

( 7 ) 去除噬菌體溶液，用 PBS-T 緩沖液洗板 8 次。

( 8 ) 加入 100 μl 的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase) / 抗M13 抗體絡合物 ( 用 PBS-T- BSA 緩沖液稀釋3000 倍，見 12.2.2.2)。溫和搖動孵育 30 min。

( 9 ) 用 PBS-T 緩沖液洗 8 次，再用 PBS 洗 2 次。

( 10 ) 用 100 μl 的 TMB 底物溶液顯影 96 孔免疫板。用 100 μl 的 1.0 mol/L H₃PO₄ 溶液終止反應，然后在 96 孔板讀板儀中讀出 450 nm 的光吸收值。