細胞和亞細胞提取物的制備實驗7

由于分子克隆技術能夠使細菌高水平表達蛋白，因此原核表達是一個非常便利的獲得重組蛋白的系統。遺憾的是這些蛋白在細菌中易于聚合和沉淀，形成難溶解的包含體，因而很難純化。非細菌蛋白的包含體尤其普遍。雖然沒有一種可用于所有蛋白的普適方法，還是有許多策略適用于包含體蛋白的溶解。本方案描述的就是這些策略之一。溶解包含體蛋白時要考慮許多步驟：

1.細胞裂解；

2.包含體的分離；

3.洗滌包含體；

4.溶解包含體；

5.重組蛋白的復性（假如需要）。

首先，在溶解之前洗滌包含體對于除去非目的蛋白和非蛋白物質是很重要的一步。比如，用1 mol/L的鹽酸胍洗滌包含奮可以從重組蛋白IL-2(Weir，etal，1987)中除去污染蛋白，而4.0 mol/L 脲可用來洗滌IL-6包含體（Zhang,et al，1992)。除去非蛋白物質（類脂）也是很重要的，這可以防止RP-HPLC層析柱被阻塞，延長層析柱的使用壽命。這可以通過用4.O mol/L脲（Zhang,etal，1992)洗包含體或用正丁醇 10 mmol/L EDTA(Weir，et al,1987)提取包含體來加以解決。然而由于空氣的氧化作用，一些目的蛋白將重折疊（如IL-6,[Zhang,etal,1992])。誘導蛋白正確折疊的常用方法是在有硫醇試劑（如1mmol/L DTT)存在的條件下，通過稀釋和透析來逐漸降低去垢劑的濃度，促使二硫鍵的正確形成。

表達目標重組蛋白的細菌細胞

復性緩沖液溶解緩沖液洗滌緩沖液

離心機

1.如實驗方案6所述裂解細胞。

2.4°C 條件下23000 g離心細胞裂解液30 min。

3.倒出上清，測定沉淀的濕重。

4.用約 10倍體積的洗滌緩沖液重懸沉淀，室溫攪動懸浮液lh。

5.4°C條件下23000 g 離心混合物30 min。

6.除去上清，并重懸沉淀。

7.重復4~5步驟3次以上（直到重組蛋白的純度>80%，用分析級 SDS-PAGE 來判斷）。

8.溶解步驟7的沉淀物，每克濕重沉淀（由步驟3決定）加人約 8 ml 的溶解緩沖液，在 4°C條件下溫和攪動混合物 16~20 min。

實驗提示：蛋白濃度不要超過 2~3 mg/ml

其他的溶解緩沖液：

（1）8mol/L 鹽酸胍，10 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 每 12~15 g 濕重的收集細胞用 15 ml 溶液溶解。37°C 孵育混合物 1h (Weir，et al，1987)。如步驟9（1） 所述變性蛋白。

（2）8mol/L脲素，2 mmol/L 還原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。

每克濕重包含體沉淀使用 9 倍體積的緩沖液。室溫孵育混合物 lh。蛋白濃度不要超過 2.5 mg/ml(Bollag，et al,1996)。如步驟9（2） 所述復性蛋白。

9.特定目的蛋白的重新折疊所需的最適條件必須通過預實驗來選擇。復性條件包括：

（1）用 1.5/mol/L 硫酸銅、50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 溶液將可溶性沉淀稀釋 25 倍，至終濃度為0.04 mol/L DTT、0.24mol/L 鹽酸胍和約1.4 ug/ml 的目的蛋白（Weir，et al，1987)。20°C 孵育混合物 2 h。

（2）緩慢將 9 倍體積的 50 mmol/L 磷酸鹽、50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA(含 2 mmol/L 還原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽）加人溶解的沉淀中。25°C 孵育混合物 2?4 h。

10.用適合于目的蛋白的濃縮步驟來回收重折疊的蛋白（如 RP-HPLC、凍干或超過濾)。