一、配制流動相以下因素與用于洗脫含有肽及蛋白質的樣品的流動相的制備有關。 1.配制各 1L 的洗脫液 A(弱流動相）和洗脫液 B(強流動相）。例如： 洗脫液 A:0.1%TFA 水溶液 洗脫液 B: 含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液（體積分數） 有機溶劑和水必須分別用兩個量筒來量，然后再混勻，因為混合時體積將會減小，最多每升可減少 30 ml(具體由溶劑的特性決定）。如果沒有按正確方法配液，將會導致流動相成分比例的偏差。 當用水/有機溶劑進行梯度洗脫時，為補償基線的變化（因為有機溶劑在短波下吸收更多的光），通常要減小洗脫液 B 中的離子對試劑的量 (TFA，H3P04)。與洗脫液 A 相比，一般減小 10%?15%(Dolan,1999)，以得到平坦的基線。 要點：用于蛋白質測序的 TFA，因其含有抗氧化劑而不適用于 RPHPLC 樣品的洗脫。
2.在有塞量筒內搖動混勻溶液，或用 Teflon 包被的磁轉子攪拌均勻（時間依溶液體積而定）。 注意：在任何情況下都不能用封口膜封閉裝有 RP-HPLC 洗脫液的長頸瓶或量筒。因為有機溶劑和洗脫液中的酸性離子對試劑會溶解封口膜，使色譜出現非特異的峰：
3.用 0.2um PTFE 過濾器過濾洗脫液 A 和 B。 過濾洗脫液可延長柱壽命，并有助于排氣。 4.未用的洗脫液瓶子用塞子密封，以防有機溶劑蒸發。 二、蛋白質樣品的制備1.用終體積一半的洗脫液 A 溶解樣品，達到所需濃度。如果樣品不易溶，則加人少量（<25% 總體積）洗脫液B。 少量強流動相將造成樣品的預洗脫，洗脫程度由進樣環大小、柱內徑、流動相梯度的起始成分決定。 2.檢測樣品純度。如果含有不溶的乳光物、蛋白質或固體顆粒，則要用0.2/um PTFE濾器過濾樣品，或者離心取上清液加樣。 警告：如果樣品未完全溶解則不能上樣，否則會堵塞加樣器和層析柱。
3.樣品應存放于4°C或一20°C，可依預計保存的時間和使用情況而定。肽和蛋白在室溫下會發生降解。 應避免樣品的反復凍融，將樣品分裝成小包裝于一20°C保存，每次取出一份使用。 三、檢測 HPLC 系統中的儀器以下實驗步驟與檢測適用于分離多肽和蛋白的 HPLC系統。 1.在與分離目的肽或蛋白樣品相同的條件下，做一組空白對照（用洗脫液A進樣），以梯度l00%A—100%B洗脫。如果出現峰，則要重復該步驟。 該步驟旨在清洗前次分離多肽和蛋白時沒能被洗脫的雜質。 2.用硫脲或硝酸鈉（或其他不會導致交叉影響的溶劑）來測量柱的死體積。 3.用梯度洗脫和適當的測試用混合物來檢測柱的工作性能。 例如下面的測試混合物：1.5 g/L二甲基鄰苯二甲酸，1.5 g/L二乙基鄰苯二甲酸，0.1 g/L聯苯，0.3 g/L鄰三聯苯，3.2 g/L鄰苯二甲酸二辛酯(用甲醇溶解）。 通過檢測能評價柱床完整性[低完整性與峰的分裂、峰的前伸（fronting)或拖尾有關]和柱性能（與塔板數有關），也能檢測柱的壽命（如果以相同的間隔時間重復檢測），并評估柱填充物批與批之間的差異。 用于檢測柱性能的膚的標準品，如Mant和Hodges(1991b)所述。 4.測量HPLC系統的梯度延遲（滯留體積）（可用另一種方法來完成此目的，見第7章）。下列幾步實驗必須在色譜柱與HPLC儀器未連接的狀態下進行。 （1）用unionpiece(相當于零長度[zero-length]柱）將加樣器直接與檢測器相連。 （2）分別配制200 ml洗脫液A和洗脫液B。 洗脫液A: 乙腈； 洗脫液B: 乙腈，0.2% 丙酮 （3）以流速20 ml/min，洗脫液B梯度洗10 min, 在254nm處檢測。 加樣技術將影響滯留體積的測量結果。如果加樣后閥值仍維持在注人樣品時的位置，則滯留體積將包括進樣環的體積；如果閥被撥到上樣的位置，則滯留體積就不再包括進樣環的體積。若進樣環>100沁，就會產生錯誤。如果進行分析性分離（如樣品環為50W)和半制備性分離（如進樣環>500ul) 的進樣環被弄混了，也會造成這種后果。 （4）測定梯度延遲時間，將結果繪制成類似于圖 5.18 所示。
 滯留體積即 VD，是從泵的頭部到層析柱人口處之間的洗脫體積（包括混合室體積）。滯留體積的大小（為 2~7 ml) 不等。自動進樣器對滯留體積有很大影響，應該補償±0.5 ml 的校正值。得到的曲線圖可用于分析評價梯度延遲時間，因為泵傳送體積的精確度也是嚴格控制的。 了解梯度延遲時間對于實驗方法的建立是十分必要的，因為這是精確計算 S 和 b 值（loc.cit) 的基礎。當建立分步梯度（此時會出現很多錯誤）或者將一臺儀器上的HPLC系統轉移到其他機器上時，梯度延遲時間的測定顯得尤為重要。 四、進行蛋白質樣品的分析性 RP-HPLC1.在分析樣品之前，在同樣條件下至少做一組空白對照。 2.用兩個因子 3 不同的分析性 RP-HPLC 過程來分離肽和蛋白質樣品（約 100ug)。
 五、梯度條件的優化
1.起始實驗在起始實驗中，將肽或蛋白質樣品在兩個不同的線性梯度條件下分離，兩個條件的不同之處在于其梯度洗脫時間把的因子 3 有所不同（其他所有的色譜參數均相同）(Dolan,etal，1989;Boysen，etal,1998)，這樣就能夠獲得每個肽或蛋白質的 RP-HPLC 滯留時間。先不考慮最佳策略，建議最好用至少兩種不同的梯度洗脫時間以鑒定重疊峰。為了優化梯度模式以獲得鄰近峰之間的最大分辨率，則有必要提高多肽或蛋白質的滯留時間的準確度，并將反映流動相組分分布和柱直徑的參數進行分類 (見表 5.9)(GhristandSnyder,1988a，1988b;Ghrist，etal,1988)。盡管確定 Vmix 非常有用（Stadalius，etal，1984)，但還是有必要確定死體積和梯度延遲時間 (Sryder，1980;Boysen，etal，1998)。
 2.起始條件的選擇
3.從起始色譜圖中計算 Inko 和 S 值
4.峰的示蹤和鑒別
5.在整個梯度范圍內優化梯度時間 tG
6.新的梯度范圍的確定
7.新的梯度滯留時間的計算在已知 S 和 Inko 知值的基礎上，可以算出新的梯度滯留時間。 8.梯度范圍的變換（可選）在測量梯度延遲時間時，應只進行多步梯度。此時，每一梯度的起始和結尾處的梯度延遲時間將會重復出現誤差。而且，在 DryLabG/plus 模擬實驗中（依 Ghrist 所列出的程序而定；Ghfist，etal，1988)，用于調節梯度起始和結束處（梯度范圍的邊緣）梯度組成的 Vmix，其產生的影響能夠使實驗中測定的滯留時間偏離預期的理想滯留時間。 9.結果的驗證優化程序完成后，可用預期的色譜條件來模擬驗證色譜的分離效果。
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