一、引言蛋 白 質 翻 譯 后 修 飾 (P T M ) 在 細 胞 生 物 調 節 中 發 揮 著 基 本 作 用 。 P T M 是 m R N A 翻譯 后 蛋 白 質 的 酶 促 共 價 化 學 修 飾 。蛋 白 質 化 學 修 飾 非 常 重 要 ，因 為 它 們 會 潛 在 地 改 變 蛋白 質 的 物 理 或 化 學 性 質 、組 成 、活 性 、細 胞 定 位 或 穩 定 性 。實 際 上 ，在 氨 基 酸 或 蛋 白 質 的 N端 或 C 端 加 入 或 移 除 化 學 基 團 會 導 致 大 部 分 蛋 白 質 發 生 變 化 。一 些 P T M 可 以 被 動 態 地添 加 或 移 除 ，這 是 一 種 可 逆 的 蛋 白 質 功 能 調 控 機 制 。 目 前 超 過 4 0 0 個 特 定 的 蛋 白 質 修 飾已 被 鑒 定 ，也 許 還 有 更 多 的 修 飾 類 型 有 待 發 現 (Creasy and Cottrell, 2004)。迄 今 為 止 最常 見 的 P T M 有 磷 酸 化 、蘇 素 化 、泛 素 化 、亞 硝 基 化 、甲 基 化 、乙 酰 化 、硫 酸 化 、糖 基 化 及 酰基 化 (表 40.1)。
 D N A 和 組 蛋 白 組 成 了 核 小 體 , 而 核 小 體 捆 綁 在 一 起 組 成 了 染 色 質 絲 (chromatin fiber)。組蛋 白 密 碼 (histone code) 假 設 染 色 質 -D N A 的 相 互 作 用 是 通 過 組 蛋 白 上 多 種 P T M 協 同 調 節的 (Jenuwein and Allis，2001; Strahl and Allis，2000)。組 蛋 白 質 上 賴 氣 酸 的 乙 醜 化 最 先 被報 道 ，并 且 與 基 因 轉 錄 活 性 相 關 (Rothet al. , 2001)。組 蛋 白 尾 部 的 甲 基 化 、乙 酰 化 、A D P -核
糖 基 化 、泛 素 化 和 磷 酸 化 等 修 飾 協 同 調 節 特 定 基 因 的 表 達 程 序 (Godde and U r a , 2008)。 磷 酸 化 修 飾 ，最 普 遍 的 P T M 之 一 ，是 許 多 生 化 學 家 的 研 究 主 題 。 目 前 估 計 3 0 % 的人類 蛋 白 質 都 發 生 了 磷 酸 化 (C o h e n , 2001; H u b bard and Coherul” 3 ) 。例 如 ，胰 島 素 /胰島 素 樣 生 長 因 子 -K I G F -1) 信 號 通 路 中 ，酪 氨 酸 激 酶 和 磷 酸 酶 將 信 號 從 細 胞 表 面 的 配 體 -結 合 受 體 轉 導 至 下 游 耙 標 (Taniguchi et al. ，2006) 。 傳 統 的 檢 測 蛋 白 質 P T M 的 方 法 包 括 E d m a n 降 解 法 和 薄 層 色 譜 法 (thin-layer chromatography,T L C ) 。 然 而 這 些 方 法 會 有 一 些 限 制 。例如 ，需 要 大 量 起 始 材 料 , 并 且 對 于鑒 定 罕 見 的 或 亞 化 學 計 量 的 P T M 無 能 為 力 。 由 于 大 多 數 P T M 都 會 導 致 與 之 對 應 的 被修 飾 蛋 白 質 的 質 量 改 變 , 因 此 ，能 夠 檢 測 蛋 白 質 分 子 質 量 改 變 的 方 法 ，即 基 于 質 譜 的 蛋 白質 組 學 ，目 前 已 普 遍 用 于 鑒 定 P T M 。一 些 P T M ，如 磷 酸 化 和 甲 基 化 , 會 增 加 蛋 白 質 的 質量 ，然 而 另 外 一 些 P T M ，像 信 號 肽 的 去 除 或 二 硫 鍵 形 成 ，則 使 蛋 白 質 的 質 量 減 少 。依 賴 于所 使 用 的 質 譜 設 備 , 本 章 所 介 紹 的 蛋 白 質 組 學 方 法 具 有 髙 靈 敏 度 優 勢 ，能 夠 以 小 于 百 萬 分
之 一（< 1 p p m ，part per million) 的 精 確 度 測 量 分 子 質 量（M a k arov et al. , 2006; L u etal. ，2008 ; Scigelova and M a k a r o v , 2006)。設 備 制 造 商 和 理 論 研 究 者 一 直 致 力 于 提 升 儀器 技 術 以 及 發 展 新 的 P T M 鑒 定 方 法（Garcia et al. ，2005; 2007)，如 近 期 這 一 領 域 內 的研 究 進 展 包 括 ，斷 裂 肽 段（fragmentation of peptide) 的 電 子 轉 移 解 離 法（electron transfer
dissociation,E T D ) 和 能 夠 精 確 測 量 未 消 化 蛋 白 質 質 量 的 動 態 檢 測 器（C o o n et al. , 2004;Mikesh et al. ，2006; Pitteri et al. ，2005; Syka et al. ，2004)。 能 夠 選 擇 性 分 離 可 能 發 生 P T M 的 蛋 白 質 或 多 肽 的 富 集 方 法 可 以 與 基 于 質 譜 的 蛋 白質 組 學 方 法 聯 用 。這 些 富 集 手 段 可 以 減 少 罕 見 修 飾 所 帶 來 的 問 題 。可 將 眾 多 可 用 的 親 和富 集 策 略 主 要 分 為 兩 類 : 第 一 類 是 用 抗 體 識 別 一 個 特 定 P T M 或 者 帶 有 特 定 修 飾 的 肽 段 ,如 抗 磷 酸 化 酪 氨 酸 的 抗 體 可 用 于 富 集 含 有 磷 酸 化 酪 氨 酸 殘 基 的 肽 段（Blag0ev et al. ，2004 ; R u s h e t a L ，2005 !Zhang etal. ，2005); 第 二 類 方 法 基 于 固 定 化 樹 脂 對 某 種 修 飾 的化 學 親 和 作 用 ，包 括 針 對 磷 酸 化 的 固 定 化 金 屬 親 和 色 譜 法（I M A C ) 和 針 對 糖 基 化 的 凝 集素 色 譜 法 (Ito et al. ，2 0 0 9 ) ，這 些 方 法 已 經 廣 泛 使 用 并 仍 在 發 展 之 中 。 另外 一 個 能 夠 有 效 鑒 定 P T M 并應用普遍的蛋白質組學方法是二 維 凝 膠電泳（twodimensional gel electrophoresis，2I> GE)。 P T M 能夠改變蛋白質的等電點及其在 2D 凝膠中的電泳遷移率。如果通過 2D 凝膠電泳發現了不同細胞種類或生長條件之間的這種改 變 ，就可以將該蛋白質分離出來，并通過測序鑒定它的 P T M 。例如, 一個蛋白質不同的磷酸化將改變它的等電點，并且可能會導致電荷異質性。這種發生不同磷酸化的蛋白質會表現為一串具有不同的等電點但是相似的分子質量的2D 斑點。這種形式有時被形象的比喻為「項鏈上的一串珍珠」。多年來已經發明了許多揭示蛋白質P T M 的特定蛋白質染色方法 (Ge et al. ，20〇4 ; Patton, 2002)，包括直接檢測膠中磷蛋白和糖蛋白的熒光方法（G e et al. , 2004; Steinberg et al. ，2001; Schulenberg et al. ，2003a ,b , 2004)。 對于這 些 2D 斑 點 ，蛋 白 質 可 被 膠 內 消 化 ，然 后 回 收 的 肽 段 通 過 質 譜 分 析 ，以 鑒 定 、驗 證 并 繪 制可 能 的 P T M 圖 譜（H a y d u k et al. ，2004; Steinberg et aL , 2003)。然 而 用 2D 凝 膠 電 泳法 鑒 定 P T M 并 非 易 事 ，因 為 修 飾 肽 段 的 回 收 和 分 析 常 常 會 出 現 很 多 問 題 。 蛋 白 質 組 學 已 有 多 種 工 具 來 量 化 蛋 白 質 及 其 特 定 P T M 的 絕 對 豐 度 或 中 度 相 對 豐 度(Paoletti and W a s h b u r n , 2006)。 目 前 已 經 發 展 多 種 體 內 和 體 外 標 記 方 法 ，可 利 用 質 譜定 量 P T M ，并 精 確 測 量 細 胞 事 件 中 P T M 的 變 化（Goodlett et al. , 2001; Gygi et al. ，1999; O d a et al. ，1999; O n g et al. , 2002; Ross et al. , 2004; Zhang et al. ，2005)。P T M 的 定 量 對 于 研 究 某 一 特 定 P T M 的 生 物 學 意 義 有 著 至 關 重 要 的 作 用 ，這 是 因 為 簡 單的 鑒 定 一 個 修 飾 的 存 在 與 否 ，有 時 并 不 足 以 提 供 足 夠 的 生 物 學 信 息 來 說 明 它 的 重 要 性 。Matthies M a n n 及 其 同 事 的 一 項 研 究 發 現 ,H e L a 細 胞 中 1 4 % 已 鑒 定 的 磷 酸 化 位 點 , 在表皮
生 長 因 子 的 刺 激 下 增 加 了 至 少 2 倍, 這說明了 P T M 定 量 的 重 要 性 (Olsen et al. ，2006)。 然而，在使用基于質譜的蛋白質組學來鑒定 P T M 時, 需考慮到某些局限性。某些P T M ，如絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸的磷酸化，以 及 O-糖基化或] V-糖基化是不穩定的，因此在樣品制備過程中維持這些修飾比較困難。而且如果沒有采用有效的分離方法, 未修飾肽段或蛋白質會影響質譜分析。當樣品中大部分蛋白質分子都未被修飾時，P T M 亞化學計量的檢測將會異常艱難。對于質譜分析，有不同廠家的眾多儀器可供選擇，它們均有各自的優點和缺陷。通常的方法是將蛋白質消化為肽段，進而直接分析肽段。一個給定肽段的修飾將會降低離子化效率，從而會影響質量譜圖，并阻礙序列鑒定。另 外 ，由于許多肽段包含眾多潛在P T M 的氨基酸修飾位點，因此有時很難判斷到底是哪一個氨基酸發生了修飾。除此之外，當使用碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID) 來斷裂含不 穩 定 PTM (如磷酸化和糖基化) 的肽段時，不穩定的基團將會發生消除反應，從而產生中性丟失碎片（neutral loss fragment)。 這個反應在能量上比酰胺鍵斷裂更有利。如此產生的質量譜圖通常不能得到足夠的測序離子，因而無法準確鑒定肽段或者被修飾的氨基酸。最后，稀 有 P T M 的檢測非常有挑戰性, 它的鑒定通常需要非常高靈敏度的質譜手段或者 P T M 富集策略。 對于使用任何一種質譜方法得到的蛋白質組學數據, 需要格外關注所獲得信息的豐度和復雜程度。典型的，在液相色譜和串聯質譜聯用分析消化蛋白質的異質混合物時，能夠產生成百上千萬的譜圖。在所獲得的質譜圖中，對于觀測到的峰有近乎無窮的 P T M和相應加合肽的可能組合。大量的數據需要一種「 in silico」蛋白質數據庫檢索算法，從而將基因組數據庫得到的理論譜與實驗所得到的觀測譜相匹配。搜索實驗譜鑒定 P T M時需要了解一些潛在修飾特性的「先驗」知識，這是因為搜索時由于計算資源有限而限制了可以納人考慮的修飾數量。例如，當僅考慮絲氨酸(S )、蘇氨酸(T )、酪氨酸(Y ) 的磷酸化時(這種磷酸化增加80 D a 標稱質量），所需的計算資源，比起搜索同樣的數據集但是沒有質量漂移的情況要高出指數數量級。這種情況的發生是由于算法不僅需要考慮沒有任何修飾的肽段，還不得不考慮當蛋白質序列中S 、T 、Y 殘基發生修飾或未發生修飾的所有情況。為解決這個問題，許多團隊一直致力于發展算法軟件，用來從質譜數據中鑒定未能預料的 P T M ( C h a l k l e y et al. ,2008; H a n s e n et al.，2001，2005; T a n g et al. ， 2005)。這些算法可以計算推測的肽段序列和實驗M S /M S 前體間的質量差異，并將質量漂移定位到肽段的序列位置（Hansen et al. ，2005)。 本章主要針對研究最頻繁的一些修飾，著重介紹質譜和蛋白質組學領域的現存和新出現的鑒定P T M 的技術方法，但這些方法的應用并不僅限于本章所介紹的內容。我們也會與討論修飾類型一樣，對于串聯質譜法中可用的技術做一概述，這些技術會影響實驗者鑒定特定P T M 的能力。前期對于 P T M 的整體分析研究凸顯了各種各樣的困難—這些困難來自于從大規模篩選所得到的大批數據中分辨可用信息。本章會給出一個工作流程示例，來幫助研究者發展最適用于研究他們當前關心的問題和可用資源的方法。除此之外，我們將概述許多可用方法來進一步定量PT M 。很 明顯，可供研究者選擇的資源和技術越來越多，這些資源和技術中很多都不僅僅可用來鑒定P T M 。 展開 | 