基于質譜的蛋白質組學分析依賴于氣相中肽段在低碰撞能量下斷裂, 在質量譜圖中形成峰。進而通過峰圖確定肽段序列,再推斷出相關蛋白質。完成肽段斷裂最主要的方法就是碰撞誘導解離(collision induced dissociation,C I D ) ( S w a n e y et al., 20 0 8)。 L T Q 、軌道阱(〇rbitraP )、q-T O F 、M A L D I -T O F /T O F 及 F T -I C R 設 備 都 能 完 成 肽 段 的 C I D 斷裂 。 C I D 最適用于小的、低電荷的、未修飾的肽陽離子(p 印tide c a t i o n K D o n g r e et al. ,1996; G o o d e t a L , 2007; H u a n g etal., 2005)。 C I D 中轉移到膚段的碰撞能量造成膚段振動激發,并分布到肽鏈中的共價鍵中。如 果 C I D 中轉移到肽段的內部能量超過了鍵斷裂 的 活 化 能 壘 ,肽 段 便 斷 裂 。如 果 這 些 碎 片 在 質 譜 儀 的 時 間 尺 度 內 發 生 ,則 被 檢 測 到 。這種 斷 裂 通 常 發 生 在 肽 鏈 骨 架 的 酰 胺 鍵 上 ,由 于 這 些 位 點 的 活 化 能 壘 較 低 ,便 產 生 了 特 征 性的 b-和 y-產 物 離 子 , 可 在 C I D 譜 中 觀 察 到(S w a n e y et al. ,2008)。
盡 管 C I D 能 夠 有 效 生 成 用 于 肽 段 測 序 的 一 組 離 子 ,但 是 也 存 在 一 些 限 制 從 而 減 弱 了斷 裂 特 定 肽 段 的 能 力 。 內 部 堿 性 殘 基 和 脯 氨 酸 能 夠 阻 止 肽 段 骨 架 的 隨 機 質 子 化 。這 些 殘基 會 將 酰 胺 鍵 的 解 離 轉 換 到 特 定 位 點 , 能 夠 抑 制 肽 段 斷 裂 ,從 而 導 致 測 序 離 子 多 樣 性 不 足(Mikesli et al. ,2006)。胰 酶 作 為 一 種 通 用 蛋 白 水 解 酶 ,通 過 產 生 在 C 端 帶 有 堿 性 殘 基的 肽 段 而 減 輕 了 上 述 問 題 。不 穩 定 的 P T M , 如 磷 酸 化 和 糖 基 化 也 表 現 出 不 同 的 低 能 量 斷裂 途 徑 。在 這 些 情 況 下 ,會 發 生 前 面 提 到 的 中 性 丟 失 事 件 ,導 致 產 生 的 譜 圖 序 列 覆 蓋 性 不足 。一 些 P T M 也 會 抑 制 肽 段 骨 架 的 隨 機 質 子 化 ,進 而 抑 制 經 由 C I D 的 斷 裂 (Tsaprailiset al. ,1999)。
一 種 替 代 的 斷 裂 方 法 稱 為 電 子 捕 獲 解 離(electron-capture dissociation,E C D ) ,能 夠克 服 C I D 的 一 些 局 限 。在 E C D 中 ,質 子 化 的 肽 段 被 F T -I C R 的 潘 寧 阱 (Penning trap)保留 ,并 受 到 一 束 帶 有 熱 能 或 接 近 熱 能 的 電 子 沖 擊 。質 子 化 肽 段 捕 獲 熱 電 子 后 會 導 致 骨 架斷 裂 ,而 分 子 內 振 動 能 并 未 重 新 分 布(Udeshi et al. ,2007)。 圖 4 0 . 4 中 描 述 了 一 種 解 釋浸 人 熱 電 子 的 肽 段 斷 裂 過 程 的 方 式 。 E C D 斷 裂 通 常 產 生 c-和Z-離 子 系 列 ,而 C I D 則 產 生b-和 y-離 子 。 E C D 是 與 分 子 大 小 和 序 列 無 關 的 過 程 ,可 以 用 來 斷 裂 完 整 蛋 白 質 。然 而 ,對 于 有 效 的 E C D ,樣 品 必 須 處 于 高 密 度 的 熱 電 子 中 。這 種 環 境 對 于 利 用 靜 電 射 頻 場 分 離離 子 的 設 備 ,在 技 術 上 較 難 實 現 , 但 是 在 使 用 靜 磁 場 的 F T -I C R 中 比 較 容 易 。另 外 ,用 于測 序 的 E C D 需 要 在 數 分 鐘 內 進 行 大 量 掃 描 ,并 取 平 均 值 。這 需 要 的 樣 品 量 較 大 ,且 對 復雜 樣 品 混 合 物 中 的 蛋 白 質 和 多 肽 的 檢 測 不 利 。
E T D 使 用 多 環 芳 香 烴 類 的 離 子 化 自 由 基 負 離 子 ,與 氣 相 中 多 質 子 化 肽 段 反 應 。這些自 由 基 負 離 子 在 質 譜 的 線 性 四 極 桿 離 子 阱 中 儲 存 。 自 由 基 負 離 子 轉 移 一 個 電 子 到 離 子 化的 肽 段 上 ,誘 發 電 荷 減 少 的 肽 段 以 E C D 類 似 的 機 制 斷 裂 ,產 生 特 征 性 的 c-和z-序 列 離 子(Syka et d . ,2004)。 E C D 和 E T D 的 斷 裂 模 式 與 肽 段 長 度 、氨 基 酸 組 成 和 P T M 的 存 在與 否 均 無 關 (U d e s h i e t a l ., 2007)。這 一 斷 裂 過 程 非 常 高 效 , 并 能 在 毫 秒 內 完 成 。 因 此 ,E T D 的 靈 敏 度 高 至 可 測 量 飛 摩 爾 級 的 樣 品 量 , 發 生 的 時 間 尺 度 與 目 前 的 色 譜 分 離 技 術 一致 (Sykaet a L ,2004)。該 斷 裂 技 術 的 主 要 優 勢 在 于 , 它 能 夠 保 持 不 穩 定 的 P T M , 同時允許 足 夠 的 酰 胺 鍵 斷 裂 ,從 而 產 生 能 夠 獲 得 測 序 信 息 的 譜 圖 。然 而 ,這 一 方 法 存 在 由 于 前 體離 子 電 荷 減 小 而 導 致 碎 片 離 子 產 量 降 低 的 問 題 。
近 期 一 項 研 究 使 用 了 E T D 和 C I D 混 合 方 法 (E T c a D ) ,通 過 C I D 來 靶 向 E T D 未解離的 電 子 轉 移 產 物 離 子 。 E T c a D 的 序 列 覆 蓋 度 中 位 值 為 88. 9 % ,而 單 獨 使 用 E T D 僅 為62.5 % ,C I D 為 77. 4 % ( S w a n e y et al. ,2007)。其 他 一 些 研 究 利 用 E T D 鑒 定 P T M J n鱗 酸 化 修 飾 。一 個 研 究 組 使 用 基 于 C I D 斷 裂 方 法 鑒 定 了 1 0 0 0 個 以 上 的 磷 酸 肽 , 但 是 僅能 鑒 定 3 8 3 個 磷 酸 化 位 點 ,這 主 要 是 由 于 修 飾 肽 段 的 中 性 丟 失 (Udeshi etal. ,2007)。使用 E T D 改 良 的 L T Q , 可 以 鑒 定 一 個 復 雜 混 合 物 中 6 2 9 個 蛋 白 質 的 1 2 5 2 個 磷 酸 化 位 點 。另 一 項 對 E T D 和 C I D 鑒 定 的 磷 酸 肽 重 疊 分 析 發 現 ,兩 種 方 法 產 生 的 兩 個 數 據 集 中 僅 有17.9 % 相 同 ( S w a n e y et al. , 2008)。這 說 明 斷 裂 并 鑒 定 P T M 位 點 的 最 好 方 法 ,也 許 就 是將 C I D 和 E T D 結 合 起 來 。圖 40. 5 展 示 了 用 兩 種 斷 裂 方 法 產 生 的 典 型 譜 圖 。在 C I D 中出 現 了 特 有 的 b-和 y-離 子 , 而 E T D 產 生 了 特 有 的 c- 和 z-離 子 。