3.1 實物庫構建
我們用 Kunkel 突變技術構建大多數的實物庫雖然我們證明了 AB 鏈套可用來結合目標分子，但多數情況下，我們用 FNfn10 的 “上” 端（BC、DE 和 FG 鏈套；圖 6.1A ) 作為目標分子結合位點 [ 10 ]。我們的方法基于 Bio-Rad 的 Mutagene kit [17]。用大腸桿菌 SS320 做電轉化，可以很容易地制備含有大約 109 個獨立克隆的實物庫。
3.1.1 尿嘧啶單鏈噬粒的制備（用于單價噬菌體展示和酵母雙雜交篩選)
( 1 ) 用 pAS47、pAS38 ( 用于獨體-基因 III ) 或 pYT 45 (用于 B42-獨體）轉化 CJ236，在 LB- AP 平板中選擇菌落。
( 2 ) 把一菌落接種到 2 ml 2X YT-Ap-氯霉素培養基，37°C 搖動過夜。
( 3 ) 將 30 ml 補充了 0.25 μg/ml 尿苷的預熱 2X YT-Ap 培養基裝入 250 ml 規格帶凹陷三角燒瓶，用 300 μl CJ236 過夜培養液接種，再加入 1010 個/ml 輔助噬菌體 KO7( Promega)。在強力搖動下于 37°C 生長 2h。加入 Km 使終濃度達到 70 μg/ml。在強力搖動下于 37°C 生長過夜。
( 4 ) 于 4°C 以 12000 g 離心 [ 10000 r/min，用 SS-34 (Sorvall) 或等效的轉子 ] 10 min。將上清液移入新試管，再次以 12000 g 離心 10 min。將上清液移入新試管。加入 4.5 ml PEG/NaCl 溶液，并徹底混合。4°C 保育過夜。
( 5 ) 于 4°C 以 17200 g 離心（12000 r/min，SS-34 轉子）20 min。拋棄上清液將試管倒放在一疊紙巾上 1 min 。用紙巾擦去殘余液體。
( 6 ) 將噬粒沉淀懸浮于 1 ml TBS 中，并移入微離心管。在微型離心機上以最大速度離心 2 min。將上清液移入新微離心管。加入 150 μl PEG/NaCl 溶液，徹底混合。在冰上保育 30 min。
( 7 ) 在 4°C 以最大速度離心 10 min。拋棄上清液，稍加離心，并用移液器除去所有液體。將沉淀懸浮于 1 ml TBS 中。
( 8 ) 用 XL-1 Blue 和 CJ236 測定噬粒濃度。將 100 μl 新鮮大腸桿菌（600 nm 光密度 OD 值為 0.5~1.0 ) 和 10 μl 系列稀釋噬粒溶液混合。室溫保育 15 min，并鋪在 LB-Ap 板上。在 37°C 保育過夜。用 CJ236 的滴定值應該是 1012~1014 個/ml，并且應該比用 XL-1 Blue 的值大 104。
( 9 ) 用 Qiagen 單鏈 DNA 制備試劑盒制備尿嘧啶單鏈 DNA。
3.1.2 尿嘧啶單鏈噬菌體的制備（用于多價噬菌體展示載體， JCFN )
( 1 ) 用 JCFN 質粒轉染 CJ236。熱激之后，與 30 ml 預熱的 2 X YT 和 500 μl 新鮮的 CJ236 ( OD600 值 0.5~1.0 ) 混合，再于 37°C 搖動 6 h。
( 2 ) 完成 3.1.1 節的步驟（4 ) 至（9 )。為測定濃度，混合 3 ml LB 和 0.7% 瓊脂糖（熔化后冷卻至 45°C )，10 μl 連續稀釋的噬粒溶液和 100 μl 新鮮的大腸桿菌。混勻并立即沖入 LB 平板中。在 37°C 培養保育過夜并測定滴度。
3.1.3 突變寡核苷酸的制備
( 1 ) 設計一寡核苷酸，取決于 GC 含量，使其分別含有大約 20 和 15 個堿基的 5' 或 3' 補區。我們使用密碼 NNK 和 NNS 來進行 “硬”隨機化，其中 N 代表所有核苷酸的等摩爾混合；K 代表 G 和 T 的等摩爾混合；S 代表 G 和 C 的等摩爾混合。
( 2 ) 將約 10 μg 溶解于水的粗寡核苷酸做丙烯酰胺凝膠電泳，切出對應于正確分子質量的帶，將寡核苷酸用電洗脫（ 見注 3 )。
( 3 ) 將 2 μg 純化的寡核苷酸、3 μl T4 多聚核苷酸激酶緩沖液、5U T4 多聚核苷酸激酶（New England Biolabs)、1.5 μl 10 mmol/L 腺苷三磷酸混合，加水至 30 μl。37°C 保育 2 h，然后 65°C 保育 15 min。將溶液在一20°C 保存。
3.1.4 雙鏈 DNA 合成
( 1 ) 混合大約 1 μg 尿嘧啶單鏈 DNA、2 μl 磷酸化的寡核苷酸（見 3.1.3)，1 μl 10 X 退火緩沖液（Bio-Rad Metagene kit ) ，加水使體積達 10 μl ( 見注4)。制備一無寡核苷酸的對照反應。
( 2 ) 使用聚合酶鏈反應（PCR) 儀，在 70°C 保溫 5 min，然后以每分鐘降 1°C 的速度，降溫至 30°C。將試管置于冰上。
( 3 ) 在退火混合物中，加入 1 μl 10 X 合成緩沖液（ Bio-Rad Metagene kit ) 、1 μl T4 DNA 連接酶和 1 μl T4 DNA 聚合酶（New England Biolabs)。在冰上和室溫相繼保溫各 5 min，37°C 保溫 30 min，75°C 保溫 15 min，然后冷卻至室溫。將 1 μl 樣品通過瓊脂糖膠 ( 電泳）。含有寡核苷酸的樣品會得到比無核苷酸的對照樣品所得分子質量高的產物。
( 4 ) 把一滴混合物放在飄在水上的 0.025 μm 透析膜碟上，透析合成混合物 1 h，然后在新的微離心管中復原透析過的混合物。使用前保存在冰上。
3.1.5 電穿孔勝任細胞的制備
( 1 ) 在 350 ml 含 Tc 的超級肉湯中培養大腸桿菌 SS-320 直至 OD600達到 0.8。
( 2 ) 在冰浴中快速冷卻三角瓶中的培養液，然后放置在冰上 15 min。將培養液移至離心瓶，在 0~2°C 以 3900 g [ 4700 r/min，用 JA -10 (Beckman) 或等效轉子 ] 離心 5 min ( 見注 5)。
( 3 ) 撇去上清液，通過在冰上敲擊離心管，將細胞懸浮于 10 ml HEPES 緩沖液中。 加入 390 ml HEPES 緩沖液，并攪動使細胞懸浮。在 0~2°C 以 3900 g 離心 5 min。
( 4 ) 撇去上清液。將細胞懸浮于 10 ml HEPES 緩沖液中并將懸浮物移至 50 ml 離心管。用緩沖液漂洗第一個瓶子并在 50 ml 離心管中恢復細胞懸浮。
( 5 ) 在 0~2°C 以 4300 g ( 6000 r/min，用 SS-34 轉子）離心 10 min。去上清液。在冰上敲擊離心管使細胞懸浮于 10 ml 10% 甘油中，然后加入 20 ml 10% 甘油，并將離心管顛倒數次以使懸浮物混合。
( 6 ) 在 0~2°C 以 4300 g 離心 10 min。去上清液。加 300 μl 10% 甘油，并在冰上敲擊離心管使細胞懸浮。檢查體積，加 10% 甘油使終體積達 700 μl。將懸浮物等分至兩個離心管中（各 350 μl)。
3.1.6 噬粒 DNA 電穿孔轉染
( 1 ) 將冷卻的 DNA [ 見 3.1.4，第（ 4 ) 步 ] 加入放在微離心管中的 350 μl 電轉化感受態細胞中，并在冰上保溫 5 min。將混合物移至預冷的電穿孔試管中（2 mm 間隙)。
( 2 ) 電穿孔細胞，如在 2.5 kV 高壓模式下使用 BTX ECM395 電穿孔器。
( 3 ) 立即在試管中加入 1 ml SOC，并使細胞懸浮。轉移細胞至 250 ml 三角瓶。加 1 ml SOC 到試管中，清洗殘留細胞并移入三角瓶中。再重復此操作 3 次。
( 4 ) 三角瓶中加入 20 ml SOC。在 37°C 以 180 r/min 搖動三角瓶 30 min。并通過放置部分稀釋的懸浮物至 LB- Ap 平板檢查濃度。
( 5 ) 將全部懸浮物加至 500 ml 預熱的 2 X YT-Ap 中。為酵母雙雜交的質粒制備，在 37°C 搖動過夜并制備質粒。為噬粒制備，加入 1010pfu/ml 輔助噬菌體 KO7，在 37°C 搖動過夜，并如 3.1.1 節所述制備噬粒。
為噬菌體 DNA 的轉化，在第 （3 ) 步之后，加入 1.5 ml 中對數期 SS -320 細胞，然后將懸浮物移至預熱的 120 ml 2 X YT-Tc。按照 3.1.2 節所述測定噬菌體濃度。37°C 保育 4 h。按照 3.1.1 節所述制備噬菌體。
3.1.7 酵母實物庫構建
為酵母雙雜交篩選，在大腸桿菌中，我們按照 3.1 節的描述構建了載體庫，然后將這個庫引入酵母中。酵母轉化系基于 Gietz 的方法 [18] 。用這個方法，我們在典型情況下得到約 106 個獨立克隆。
( 1 ) 在 30°C，20 ml YPD 中搖動過夜生長酵母 EGY48。將培養液加入預熱的 300 ml YPD 使 OD600 值為 0.25。讓細胞生長直至 OD600 值接近 1。
( 2 ) 在室溫下以 3600 g ( 4500 r/min，JA-10 轉子）離心 5 min 。撇去上清液，并懸浮細胞于 300 ml 滅菌水中。重復離心和懸浮。再離心，懸浮細胞于 25 ml 滅菌水，并移至 50 ml 離心管中。室溫以 3000 g ( 5000 r/min，SS34 轉子）5 min。撇去上清液，并懸浮細胞于 1.2 ml 滅菌水。
( 3 ) 將 35 μl 細胞懸浮物放在一邊用作負對照。在余下的細胞懸浮物中加入 7.2 ml 50% PEG3350、1.08 ml 1 mol 乙酸鋰、500 μl 攜帶子單鏈 DNA ( Origene) 、45 μg DNA 和 900 μl 水。徹底混勻，并每份 360 μl 分裝入 30 個微離心管中。在負對照管中加入 1/30 除 DNA 外的上述材料（即 PEG、乙酸鋰和攜帶子 DNA ) ，徹底混勻。
( 4 ) 在 42°C 保育 40 min。在微離心機上以 10000 r/min 轉速室溫離心 10s，撇去上清液。懸浮每管中的細胞于150 μl 水中。將細胞鋪在直徑為 15 cm 的篩選平板上（YC Glc trp - ) 上 。30℃ 保育 3 d。
( 5 ) 每皿加入 15 ml 水，用滅菌的蓋玻片刮散所有菌斑。把所有細胞懸浮在 500 ml 離心管中，并以 3900 g ( 4700 r/min，JA-10 轉子）離心 5 min。撇除上清液，懸浮細胞于 500 ml 水中。再次離心并撇除上清液。懸浮細胞于 50 ml 水中，并測量 OD600 以確定細胞密度（ 1 OD600 對應于約 2X107 個/ml ) 。加入甘油至終濃度 15% ( V/V ) 。分裝并保 存細胞懸浮物于 -80°C。
3.2 噬菌體展示庫分類
3.2.1 掃視（panning)
( 1 ) 加入 50 μl 涂漬溶液到酶聯免疫吸附試驗酶標板（Nunc Maxisorp，可分小孔，C-bottom ) 的小孔中（每孔1 μg 的配體）。把酶標板放入一鋪有濕紙巾的密封盒子中。保持盒子在 4°C 過夜，或 37°C 1 h。
( 2 ) 用移液器除去液體，并用水清洗小孔兩次。加入 360 μl 含 3% BSA 的 TBS 于小孔中。37°C 保育 1 h。為了下一輪實驗，制備一對照小孔；加入無配體的緩沖液，并用 BSA 封閉小孔。
( 3 ) 從小孔移除封閉液，用水清洗兩次。加入 12 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 噬菌體懸浮物（1011 個/孔）。室溫保育 2 h。
( 4 ) 移除噬菌體溶液，然后加入 360 μl TBST。用吸管上下有力地吸動。等待 5 min 然后移除溶液（ 第一輪一次，以后每輪 5 次)。
( 5 ) 在小孔中加入 50 μl 含有 10 μmol/L 配體的 TBST 溶液。37°C 保育 1 h，用吸管上下有力地攪動，回收洗脫物。也可以加 50 μl 酸性洗脫緩沖液到小孔中，室溫等待 10 min。用吸管上下有力地攪動。回收第二次洗脫物到裝有 3 μl 2 mol/L Tris-堿的微離心管中，準備中和。
( 6 ) 混合 5 ml 新鮮的 XL- 1 Blue ( OD600 值為 0.5~1；在 LB-Tc 中生長的）和洗脫的噬菌體。對噬菌體，加入 100 ml 2 X YT [ 和異丙基巰基半乳糖苷（ IPTG ) 直至 1 mmol/L 以得到獨體的高產出 ]，并在劇烈搖動的同時，于 37°C 保育 6 h ( 更長的保育時間可能導致獨體基因刪除）。加入 2 X YT 后立即按 3.1.2 節所描述的測定濃度。對噬粒，混合 5 ml 新鮮的 XL-1 Blue 和洗脫的噬粒，37°C 保育 20 min、加入 100 ml 2 X YT ( 以及 IPTG，如果需要）、100 μg/ml AP 以及 1010個/ml 的輔助噬菌體 KO7；在 37°C 保育 2 h 并保持有力地搖動。Km 至終濃度 70 μg/ml 并保育過夜。保育 20 min 后立即按 3.1.1 節描述測定濃度。按 3.1.1 和 3.1.2 節所述，分 離噬菌體（或噬粒)。重復整個步驟，直至洗脫的噬菌體（或噬粒）數增加。
3.2.2 單噬菌體克隆的鑒定
( 1 ) 從單克隆中制備噬菌體（或噬粒)。對噬粒，在 2 ml LB-Ap 上過夜生長一單菌落。混合 20 μl 培養液、2 ml LB-Ap ( 和 IPTG，如愿意的話）和 1010 個/ml 輔助噬菌體 KO7。37°C 劇烈搖動保育過夜。對噬菌體克隆，用滅菌的牙簽接觸一單菌斑。將牙簽放在 2 ml 含 100 μl 新鮮 XL-1 Blue 的 LB-Ap ( 和 IPTG，如果需要的話）中，37°C 劇烈搖動保育 6 h。按 3.1.1 和 3.1.2 節所述，制備噬菌體（或噬粒)。
( 2 ) 對每一個要測試的克隆，完成 3.2.1 節的第 （1 ) 和第 （2 ) 步，來準備一帶有固定目標分子的小孔。同時用不含目標分子的涂漬溶液涂漬，來制備另一對照用小孔（見注6 )。
( 3 ) 加入 5 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 從單克隆制備的噬菌體懸浮液到配體涂潰的和對照的小孔中。視相互作用強弱，調節噬菌體濃度（典型值：每孔 108~1011 個）。在攪拌 器上室溫保溫 2 h。
( 4 ) 用 TBST 沖洗 5 次。用噴水瓶在所有小孔中加入 TBST，然后清除液體，將平板翻轉面朝下拍在一疊紙巾上。
( 5 ) 在每一個孔中，加入 50 μl 抗噬菌體-辣根過氧化物酶的抗體溶液（Phamacia; 在 TBST : BSA 中稀釋1 : 2000)， 在攪拌器上室溫保溫 1 h。用 TBST 清洗 5 次。
( 6 ) 加入 50 μl 1step turbo-TMB (Pierce) ，等待約 10 min 直到藍色顯現，并加入 50 μl 2 mol/L 硫酸以終止反應 （ 使用有濾嘴的槍尖以保護移液器）。用平板讀出器測量 OD450。選擇對配體涂漬的小孔有高親和力并對對照小孔呈低親和力的克隆，以備進一步檢測（測序、親和力優化和蛋白質生產）。
3.3 酵母雙雜交篩選
3.3.1 目標（“誘餌”）質粒的制備
在 pEG202 中克隆誘館基因，使得誘餌與 LexA 在同一可讀框表達。重要的是確認 LexA- 誘餌自己不激活報告基因，也不與野生型 FNfn10 相互作用。用相互作用交配法，這很容易測試 [13，19 ] 。
( 1 ) 用 LexA-誘餌質粒 [ 或 pEG202 作負對照，pBait (Origene) 作正對照 ] 和 pSH18-34 ( β-半乳糖苷酶報告質粒；Origene) 轉化 RFY206，并在 YC Glc his- ura- 平板上選擇。也 用 pYesTrp2 ( 激活子 B42 質粒；Invitrogen )、pTarget (正對照；Origene ) 或 pYT45 轉化 EGY48，并在 YC Glc trp-平板上選擇。
( 2 ) 在 YC Glc his-ura- 平板上兩個菌斑的每一個上用 LexA 質粒和報告質粒上平行劃痕。在 YC Glc trp - 平板用 B42 質粒以同樣的方式劃痕。30°C 保育兩塊平板 1~2 d。
( 3 ) 復制兩塊平板至一 YPD 平板。從兩塊板上來的劃痕應該互相垂直，以使 EGY48 細胞和 RFY206 細胞在交疊處雜交。30°C 保育過夜。
( 4 ) 將 YPD 平板復制至 YC Glc leu- his- trp - ura、YC Glc his- trp- ura- 和 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板，并在 30°C 保育 3 d。所有雜交細胞應該在 YC Glc his- trp - ura- 平板上生長。在 YC Gal Raf leu - his- trp - ura- 平板上的生長指示“誘餌”和 “捕食者” 的相互作用。其他平板用于對照。
3.3.2 酵母雙雜交庫篩選
含有誘餌的 RFY206 與含有獨體庫的 EGY48 雜交，并選出含有獨體和誘餌的細胞。酵母雜交的應用，使得可以有效地篩選多個庫 [13] 。
( 1 ) 在 30°C，10 ml YC Glc his - ura- 培養基中，生長 16 h 駐有 pSH18-34 和 LexA-誘餌質粒的 RFY206。
( 2 ) 用 1.0 OD600= 2.0 X 107 個細胞/ml 換算，通過 OD600 測定細胞濃度。108 個誘餌細胞放在微離心管中以 10000 r/min 的轉速在微離心機上離心 30 s，使細胞旋轉沉降，用 200 μl 培養基讓細胞懸浮。
( 3 ) 加入 107 個駐有獨體的 EGY48 細胞到誘餌細胞中（見 3.1.7 )，并在 YP 平板上鋪開。讓細胞雜交 16 h。
( 4 ) 用 5 ml ( 每次用 1 ml) YPD 培養基將細胞從平板上沖洗下來。100 倍稀釋后測量 OD600，將 108 個細胞鋪在 5 個 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 培養基平板上。于 30°C 保育這些平板 3~4 d。
( 5 ) 復制菌落到 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 培養基平板和 YC Gal leu- his- trp - ura-培養基平板上。保育 16~24 h。真的正克隆將只會在 YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板上生長。
( 6 ) 在通風廚內，打開平板蓋，加入足夠氯仿以覆蓋板表面。5 min 后將氯仿倒入廢物罐，并讓剩余的氯仿揮發 10 min [ 20 ]。
( 7 ) 在微波爐內加熱瓊脂糖 -磷酸鹽溶液（每皿 10 ml ) ，以溶解瓊脂糖，在水浴中冷卻到 50°C。在試管中加入 35 μl 50 mg/ml X-gal 溶液和 10 ml 瓊脂糖-磷酸鹽溶液，攪拌，并倒入平板中。30°C 保育。觀察顏色。挑出呈現藍色的克隆以備進一步檢驗。
3.3.3 分離獨體的特異性檢測
( 1 ) 于 30°C，在 1.5 ml YPD 培養基中，培養從庫中篩選出來的感興趣的酵母細胞 16 h，并用 Y- DER 酵母 DNA 抽提試劑盒（Pierce) 從酵母細胞中制備 DNA。
( 2 ) 將透析后的酵母 DNA 用電穿孔注入大腸桿菌 KC8 細胞（見 3.1.4)，并在 LB-Ap 平板上挑選轉化細胞。
( 3 ) 在基本 trp-Km 平板上復制菌落，并于 37°C 保育。選取兩個菌落分別接種于 2 ml LB-Ap 培養基中，于 37°C，培養 10 h，并用標準方法抽提質粒 DNA。生長超過 10 h 的 KC8 細胞常產生不純的質粒。用標準的 DNA 測序法測定獨體片段的序列（見注 7 )。
( 4 ) 用 B42-獨體質粒轉化 EGY48，并用相互作用雜交法測定其與各種誘餌的相互作用（見 3.3.1)。
3.3.4 液相 β-半乳糖苷酶測試
生化測量之前，誘館與獨體的親和力可用液相 β-半乳糖苷酶測試半定量地加以確定。這個方法比 3.3.2 小節描述的平板測試更為定量。我們改進了這個方法使之適用于 96 孔平板格式（見注 8 )。
( 1 ) 用 pSH18-34、LexA- 誘餌質粒（pEG202 的衍生物）和 B42 獨體質粒 ( pYesTrp2 衍生物）轉化 RFY206 酵母菌株。把一個菌落接種至 2 ml YC Glc his- ura-trp -，于 30°C 搖動過夜。
( 2 ) 稍稍離心以移除培養基，在溫熱的 YC Glc his- ura-trp- 中懸浮直至 OD600 值為 0.2。于 30°C 搖動 6 h。測 定 OD600 值并以每 350 μl 裝入微離心管中。典型地，我們每次測量三遍。
( 3 ) 將 2 X β-半乳糖苷酶測試溶液與 Y-Per ( Pierce) 按 1 : 1 混合作為工作溶液。加 350 μl 工作溶液到每個樣品中。多次翻轉以混合。
( 4 ) 30°C 保育，同時檢查顏色。當呈現黃色時，加 300 μl 0.5 mol/L 碳酸鈉入離心管，并徹底混合。以最大速度離心微離心管 1 min。測定上清液的 OD420 值。
3.4 獨體的克隆、表達、純化和生物素化
當從庫中篩選出具有所期望特性的獨體后，其基因轉染至大腸桿菌表達載體，獨體則被表達純化為一分離的蛋白質。我們在典型情況下每升培養液得到 10~15 mg 獨體。我們也描述了為在免疫化學應用中便于探測而使獨體生物素化的操作步驟。
3.4.1 獨體的克隆
用寡核苷酸 NdeMetThrFNF(5'-CGGGATCCCATATGCAGGTTTCTGATGTTCCGACCGACCTGGAAGTTGTTGCTG-3'；它包含 Arg6 到 Thr 的突變）和 FNGKKGKR ( 5’-CCG ACTCGAGTTACTATTTACCTTTTTTACCGGTACGGTAGTTAATCGAG-3'），擴增感興趣的獨體基因，然后用 Nde I 和 Xho I 降解并克隆到用同樣的酶降解過的 pET15b (Novagen) 中。通過測序確認表達載體中基因。
3.4.2 獨體的表達
此操作步驟適合于 100 ml 培養液，對初步鑒定而言，這樣的量應該能產生足夠的獨體。
( 1 ) 用獨體表達載體轉化 BL21 ( DE3 ) 細胞（Novagen) ( 見注 9) 。
( 2 ) 接種轉化細胞至 10 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在強烈搖動下，于 30°C 保育 10~16 h。
( 3 ) 接種 2 ml 預培養液至預熱的 100 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在強烈搖動下于 37°C 保育。當 OD600 值達到 0.7 時，加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/L。
( 4 ) 在強烈搖動下于 37°C 保育 3 h 多，并離心收集細胞。細胞可存儲于 -20°C，直至使用。
3.4.3 獨體的純化
此操作步驟適合于 100 ml 培養液（見 3.4.2 )。
( 1 ) 懸浮細胞沉淀于 6.4 ml pH 8.0 的 50 mmol/L Tris-氯化氫中。
( 2 ) 加入 64 μl 50 mg/ml 溶菌酶和 128 μl 50 mmol/L PMSF。混合并于 37°C 保育 15 min。超聲破碎并懸浮直至不再有高度黏滯性。
( 3 ) 加入 910 μl 40 mol/L 氯化鈉。于 4°C 以 27000 g ( 15000 r/min，SS34 轉子）離心 10 min。收集上清液。
( 4 ) 將蛋白質溶液放入裝載了 0.1 mol/L 氯化鎳并用緩沖液 B 平衡過的 Hi-Trap 螯合柱中 （ 1 ml；Amersham-Pharmacia Biotech) 。先用 6 ml 緩沖液 B， 再用 6 ml 含 60 mmol/L 咪唑的緩沖液 B 洗柱。
( 5 ) 用 6 ml 緩沖液 C 洗脫獨體。收集 0.5~1 ml 每份的洗脫液到微離心管中。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析洗脫液。
3.4.4 獨體的生物素化
我們連接生物素到 Lys 的氨基。這雖然不是位點特異的，但在 C 端的擴展部分成團的 Lys 應該是最易發生的修飾位點。這個方法可用來連接其他的片段，如熒光染料。
( 1 ) 完成 3.4 3 小節中純化操作的步驟（1 )~( 4 )。
( 2 ) 用 10 ml 緩沖液 D 清洗柱子。
( 3 ) 溶解 1 mg D-生物素- ε - 氨基己酸輕基琥拍酰亞胺脂（BoehringerMannheim) 于 50 μl 二甲基亞砜，并將其稀釋至 3 ml 緩沖液 D 中。注射 1 ml 溶液到柱中并于室溫黑暗中保溫 1 h。再重復反應 2 次。
( 4 ) 用 6 ml 緩沖液 B 洗柱，并按 3.4.3 節第（ 5 ) 步所述洗脫獨體。 展開 | 