在蛋白質純化方法中抗體親和純化是非常有效的方法之一。僅此一步常可獲得 1000～10 000 倍的純化。如果抗體與目的蛋白的結合的特異性得到證明，并且洗脫的目的蛋白沒有受到不可逆的損傷，那么可以認為免疫純化是極好的蛋白質純化方法，特別是用在純化過程的最后步驟。
| 實驗方法原理 | 制備免疫親和柱要求抗體首先共價結合到介質上。另一方法是將抗體結合到蛋白 A 或 G 小珠上，再用交聯劑固相化。后一方法由于蛋白 A 或 G 結合在杭體的 Fe 區， 所以結合抗原的部位獲得充分暴露，從易于接近。免疫親和柱制備完成后，抗原溶液即可以上樣，接著洗去污染物，然后洗脫抗原。如果不能利用特異的配基破壞抗原抗體之間的相互作用來洗脫，只好釆用非特異洗脫方法。但是非特異洗脫方法一定要小心應用，以免目的蛋白失活。
單克隆抗體通常在免疫親和純化中比多克隆抗體更有用。單抗代表與目的蛋白具有單一特異結合部位的均一抗體，因而它的結合是確定一致的。洗脫也如此，因為只需破壞單一類型的相互作用就能釋放目的蛋白。應當說，多克隆抗體在親和純化中也是可用的，特別是用很純的抗原免疫動物產生的多克隆抗體。總之，進行有效的免疫純化的主要關鍵是獲得特異抗體，它與底物之間具有 YI 一定強度的親和結合力。該強度的結合力一方面可以在洗柱過程中保持底物蛋白仍然結合在柱上，不被洗脫；另一方面又不至于結合太緊難以洗脫，采用極端洗脫條件而造成底物蛋白變性。所以選擇用于免疫純化的抗體的方法應是試驗一組單克隆抗體，挑選不僅具有足夠的親和結合力，而且還能洗脫下完整抗原的抗體。
免疫純化的質量取決于抗體溶液的純度。制備免疫親和柱使用的抗體既要具有前面提到的特性，又要盡可能的純。免疫親和柱的制備是相當昂貴的，其結合容量卻相對較低，常常每 ml 介質結合到 1 mg 抗原。因此為了節省和提高效率，經常制備的是小而粗的柱子，同時在親和純化步驟里要求樣品溶液重復幾次上樣，以便純化更多的抗原蛋白。此外，較小的柱子也可以減少和限制柱污染或蛋婦酶滅活造成的抗體丟失。
免疫沉淀也可看作另一類型的免疫和純化。還有一個類型是反向免疫純化，它利用抗體柱除去溶液中特異的污染物一抗原。 |
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| 實驗材料 | 抗原 |
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| 試劑、試劑盒 | PBSHClNaN3 |
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| 儀器、耗材 | 離心機 |
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| 實驗步驟 |
1. 5～10 倍柱體積的起始緩沖液，如磷酸緩沖鹽液（PBS）洗柱；
2. 3～5 倍柱體積的冼脫緩沖液，如 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl 洗去污染物；
3. 5～10 倍柱體積的起始緩沖液平衡柱；
4. 通過透析、凝膠過濾、加 1/10 體積 10× 起姶緩沖液至樣品液等方法用起姶緩沖液平衡樣品。樣品需事先 100 000×g，離心 30 min 或經 0.22 um 濾膜過濾處理；
5. 上樣到柱子。上樣時較慢的流速可以獲得更好的抗原結合。樣品應循環重復上樣幾次；
6. 5～10 倍體積起姶緩沖液洗柱，或用該液洗至 A280 值達到基線或本底水平。若抗原抗體相互作用較強，起始緩沖液內可含一定濃度的鹽，如 0.5 mol/L KCl 以減少非特異結合；
7. 2 倍體積洗脫緩沖液，如 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl， 洗柱，以 1 ml 為單位分部收集洗脫液。每個收集試管預先加入 0.1 ml，1 mol/L，pH 8.0 Tris-HCl 立即中和洗脫液的低 pH；
8. 檢測各組分，合并活性組分；
9. 如果抗原的穩定性有限需要立即更換緩沖液，則通過透析或凝膠過濾完成；
10. 10 倍體積 0.2mol/L，pH2.5 glycine-HCl，洗柱，然后用 10～20 倍體積 PBS 洗柱，要儲存時用含 0.02％ NaN3 的 PBS 洗柱。 展開 |
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| 注意事項 |
配基在使用的緩沖液 pH 條件中應是穩定的。不要讓柱內溶液流干。所有溶液都故經過 0.22 um 濾膜過濾除菌，以獲得最大柱壽命。介質的抗原結合容量測定，可在試管內進行。該試驗是在一組試管中加入恒定量的抗體介質及遞增的抗原，混合后測定。 |
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