就像轉移質粒的改進，對親代桿狀病毒基因組的改進也是為了滿足各種不同的需要。
起初，最主要的目的是找到克服重組桿狀病毒載體構建和分離低效率的方法，這也是最初的桿狀病毒-昆蟲細胞系統存在的主要問題。現在已經知道這個問題的根源在于, 在共轉染的昆蟲細胞系中，轉移質粒和親代桿狀病毒 DNA 的同源重組效率很低。最終，研究人員想出了一些直接和間接的方法來解決這個難題。
Kitts 和Possee構建出具有線性DNA基因組的桿狀病毒，向問題的解決邁出了重要的第一步（Kittsetal.，1990)。這種病毒是通過最初的同源重組方法獲得的重組桿狀病毒，其主要特點是在多角體蛋白基因座位有一段新的 DNA序列，該序列具有Bw36I的酶切位點(圖14.3)。因此, 該基因組能夠被5似361線性化并作為親代病毒 DNA與轉移質粒混合后共轉染昆蟲細胞。這種方法最大的特點是線狀的親代病毒 DNA分子不會復制。因此，線性化在很大程度上減少了共轉染昆蟲細胞中親本子代的數量。另外，線狀病毒DNA仍然可以與轉移質粒進行同源重組，重組后病毒DNA分子重新形成環狀結構并恢復復制能力。這些因素加起來，使得共轉染的昆蟲細胞中重組桿狀病毒載體的產生效率從0.1% 增加到10%~20%，也使該技術得到了極大的簡化。Kitts和Possee對該方法做了改進，他們構建了一個稱為BakPAK6的重組桿狀病毒，該病毒可以被Bm36I切開。BakPAK6基因組具有一個位于多角體蛋白基因座位的大腸桿菌^cZ基因，該基因內有一個B361位點，另外還在病毒基因的上游和下游分別引入一個Bsw36I位點(圖14.4)。重要的是，經過&M36I的消化，or/1629 的一部分被刪除，w/1629是病毒的一個必需基因，它位于多角體基因的下游，編碼了病毒核衣殼的鱗蛋白（nucleocapsidphosphoprotein)(VialardandRichardson,1993)。將BakPAK6作為親代病毒DNA，通過共轉染昆蟲細胞的方法構建重組桿狀病毒載體的效率增加到95%。BakPAK6的成功刺激了多種線性化的桿狀病毒DNA的商業化和廣泛應用。它們被用做構建重組桿狀病毒載體的起始材料。這些商業化的桿狀病毒DNA中，最主要的包括ClonTech商業化的原始的 BakPAK6病毒DNA。類似的還有預線性化的稱為BaculoGold的病毒DNA(Pharmingen/BDBiosciences)、Novagend的 BacVector、Sigma-Aldrich的 Diamond-Bac。此外，一個稱為BaoN-BIue(Invitrogen)的是經過輕微改進的線性化病毒DNA/轉移質粒系統, 重組后, 其基因組內的大腸桿菌標志物會得到重建。
在本章的此處，強調這些病毒DNA骨架的發展是很重要的，它們有效地解決了本書第一版出版時在構建桿狀病毒表達載體時存在的主要問題。這些線狀的桿狀病毒DNA被商業公司廣泛的市場化并且很快就被生物醫學研究機構承認和接受，作為重組桿狀病毒構建的改良工具。這些工具和方法 (見下面相關內容)的出現讓具有基礎分子生物學背景的實驗室普通研究人員能夠更容易地運用桿狀病毒表達載體。最終，桿狀病毒-昆蟲細胞系統得到了更廣泛地應用，并且作為重組蛋白制備的有效工具得到了普遍地認可。
與此同時，Luckow和他的同事們發展了一種與線性化病毒基因組不同的方法來分離桿狀病毒載體。他們的方法利用了遺傳轉座(genetictransposition), 而不是同源重組(LuckowetaL,1993)。該方法通過使用不同的分子機制來產生重組桿狀病毒DNA從而使研究人員解決了同源重組的低效問題。該方法的關鍵在于構建一個新的大腸桿菌菌株, 該菌株具有一個包含完整桿狀病毒基因組拷貝的能夠自主復制的質粒, 或稱桿粒(bacmid)(圖14.5)。桿粒的多角體蛋白區域包含大腸桿菌ZacZ基因和mini-AttTn7位點，它是轉座的附著位點（attachmentsite)。這株新構建的大腸桿菌菌株還有一個編碼轉座酶(transposase)的輔助質粒。使用桿狀病毒轉移質粒轉化該新型大腸桿菌菌株，由于轉移質粒上的多角體驅動的目標基因的側翼序列為Tn7附著位點的左端和右端, 該嵌合基因會轉座至桿粒上的多角體區域。轉座時會導致桿粒上的fccZ基因的刪除，這就可以通過在篩選培養基上進行藍、白斑篩選來鑒別含有重組桿粒的細菌。這樣，你就可以從具有白色菌落的大腸桿菌克隆中簡便地分離出含有編碼目標基因的重組桿粒DNA去轉化昆蟲細胞。DNA轉化會啟始病毒的感染并導致子代重組桿狀病毒的產生。這種體內轉座法可以以100% 的效率產生重組桿狀病毒DNA。它的商業化產品最初稱為Bac-toBac系統，由LifeTechnologies 公司開發，而現在可以從Invitrogen公司購買。Bac-toBac系統以細菌為中心的特點是很重要的，因為它可以讓不熟悉病毒學而更熟悉細菌學和分子生物學的研究人員仍然在自己熟悉的領域工作。但是，該系統存在的一個不足是重組桿狀病毒保留了細菌的復制子，與不含有該結構的病毒相比，它使桿粒在昆蟲細胞中傳代時具有高度的遺傳不穩定性[Pijlman等(2003) 及見下文]。
近期,Possee和King的研究小組提出了一種更為聰明的想法，該方法是線性化桿狀病毒DNA法和桿粒法的交叉雜合（P0sseeetal.，2008)。從本質上講，他們構建了一個新型的具有重組桿狀病毒基因組的桿粒，該基因組在多角體座位有一個細菌的復制子(replicon)且缺失了下游的烈基因（圖14.6)。由于存在細菌復制子及缺失了基因，這個桿粒可以在大腸桿菌中復制, 但是不能在昆蟲細胞中復制。因此，可以使用攜帶有這種桿粒的大腸桿菌方便地制備用于構建重組子代病毒載體的親代桿狀病毒基因組 DNA。你可以簡單地從大腸桿菌中分離出病毒DNA，與轉移質粒混合后共轉染昆蟲細胞。在病毒與轉移質粒DNA之間的同源重組會同時恢復#/2629，在多角體蛋白基因座敲除細菌復制子并且在相同位置插入目標基因。盡管這種方法沒有提高同源重組的效率，但是明顯提高了在共轉染的昆蟲細胞中產生重組桿狀病毒的效率，因為親代病毒DNA 是有缺陷的，不能自我復制。該方法已經由oxfordExpressionTechnologies進行了商業化，產品為flashBAC。flashBAC系統有一個值得再次強調的特點，如上所示, 細菌的復制子在同源重組中被剔除。這樣做的優點在于消除了用常規桿粒(保留有細菌的復制子)制備桿狀病毒載體時的遺傳穩定性問題(Pijlmanetal.，2003)。另一個值得再次強調的特點是在flashBAC系統中使用的桿粒包含了在昆蟲細胞中不能復制的缺陷型桿狀病毒基因組。顯然，這就意味著在該系統中，需要親代缺陷型病毒基因組與轉移質粒之間的同源重組來形成不需要輔助的子代桿狀病毒。但是，這并不一定意味著共轉染的昆蟲細胞將只能產生重組的子代桿狀病毒。由于遺傳互補作用（geneticcomplementation)，這些細胞也能夠產生源于缺陷型親代病毒基因組的子代病毒。特別的是，在共轉染的昆蟲細胞中產生的重組病毒能夠提供的產物，它為缺陷型病毒DNA的順式裝配提供了輔助功能。使用flashBAC系統制備桿狀病毒時至少要進行一輪空斑純化，然而OxfordExpressionSystems的商業文獻指出這是不必要的。不進行空斑純化，通過共轉染昆蟲細胞獲得的原始重組病毒將會污染有缺陷型的親代病毒, 它們會干擾接下來的載體復制與外源基因的表達。
制備桿狀病毒載體最簡單的途徑可能是使用一種交叉雜合了Gateway技術與線性化親代病毒DNA技術的方法（Hartley,2003;WalhoutetaL,2000)。該方法涉及編碼目標蛋白質的Gateway進入質粒(entryplasmid)以及線狀的親代病毒DNA在體外而不是體內的重組。在這個系統中, 親代病毒DNA以線狀的形式存在，其基因組中的多角體蛋白編碼序列被大腸桿菌LacZ基因和單純痕瘆病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶(thymidinekinase)基因替換，替換序列的兩側有噬菌體1的位點特異性重組位點（attRl 和 attR2; 圖M.7)(site~specificrecombinationsite)。含有LacZ基因的病毒呈現出藍色空斑，在添加有某種核苷類似物（nucleosideanalog)，如丙氧鳥苷（gancyclovir)的昆蟲細胞中培養，胸苷激酶基因提供了針對親代病毒DNA的陰性選擇標記。將線性化的病毒DNA與編碼目標蛋白質的 DNA進人質粒混合，目標蛋白質編碼序列的側翼序列為A噬菌體的位點特異性重組序列（attLl和attL2)，在混合物中加人純的重組酶^沈。!^!^-nase)(LRClonase;Invitrogen), 該酶會介導進人質粒和親代病毒上att位點間的位點特異性重組。需要重點指出的是, 該體外反應是一種非定量意義上的高效重組反應，其產物為親代桿狀病毒DNA與重組桿狀病毒DNA的混合物。隨后，該混合物通過轉染進人昆蟲細胞，像前面指出的那樣，在含有丙氧鳥苷的培養基中培養，丙氧鳥苷能夠阻止親代病毒的復制。經過一輪篩選，子代重組桿狀病毒載體的數目得到增加，通過空斑形成實驗可以從相對較低水平的子代桿狀病毒背景中將其檢出。在，半乳糖苷酶顯色底物存在的情況下，重組體的空斑表型為白色，可以依此很容易地將其鑒定出來。這種在體外獲得重組桿狀病毒載體的方法，最初是由Franke與他的同事在LifeTechnologies研發出來的。
然后由Harwood和他的同事在Invitrogen將其商品化為BaculoDirect系統。該系統使用起來非常地快速、有效和簡單。但是，需要著重指出，與flashBAC系統類似,BaculoDirect系統在市場上被宣傳為「無需空斑純化或細菌中的篩選，即可從桿狀病毒克隆與表達基因」，就像前面指出的那樣，這不是好的建議，盡管胸苷激酶基因產物和丙氧鳥苷的存在會對親代病毒產生一個負向選擇壓力，但用體外重組產物轉染的昆蟲細胞仍然既會產生重組體子代又會產生親代病毒的子代。因此，研究人員在使用BaculoDirect系統時不要輕信廠商宣稱的內容，相反應進行至少一輪的空斑純化將具有目標基因的重組桿狀病毒從親代病毒污染中分離出來。事實上, 那些接受了該建議并且使用了含有，半乳糖苷酶的瓊脂層進行空斑純化的研究人員通常至少會看到一些藍色的斑點，這顯示親代病毒的存在并肯定了對重組桿狀病毒的空斑純化是明智的決定。公平地說，商業化的BaculoDirect系統的操作手冊(Invitrogen)包括了在含有/■半乳糖苷酶的培養基上進行空斑純化的方法，這提供了很大的便利。
在了解了上述體外重組方法的基礎上，還應對一些已經公開出版的直接體外重組DNA法進行簡短的介紹。這些方法涉及對改進后的桿狀病毒基因組進行消化及其后與外源DNA片段的直接連接。這些方法的一個實例涉及在AcMNPV基因組上多角體蛋白啟動子下游引入兩個&m36I位點（LuandMiller,1996)。這兩個位點的識別序列有著微小的差異。經&w36I位點消化后產生5’-TTA^的單鏈突出序列（singlestranded5’-TTA-3’overhangingsequence)，該序列可以在dTTP存在下被大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段轉化為 5~TT-3’的單鏈突出。這就產生了一個線性的桿狀病毒DNA分子，任何DNA片段都可以與其進行連接，只要它經過Ec0RI酶切后產生y-AATT-3’的單鏈突出，然后再經Klenow片段和dATP處理為V-AAW的單鏈突出。這種改進的主要目的在于給以桿狀病毒為基礎的cDNA表達庫的構建提供方便。其他兩個直接體外重組的實例都涉及在桿狀病毒基因組中引人歸巢內切核酸酶（homingendonuclease)的酶切位點。其中一個是在AcMNFV基因組中引入一個I-Sce-I位點來構建一個命名為Ac-Omega的重組體（Ernstetal.，1994)。分離自該病毒的基因組DNA可以被I-Sce-I消化后與被同樣的酶處理過的DNA片段連接。另外一個被命名為Homingbac系統，它涉及在許多不同的桿狀病毒基因組中引入一個單一的I-Cew-I位點（Lihoradovaetal.，2007)。從這些病毒中分離的基因組DNA被I-Cew-I線性化后可與用BsfXI處理后具有可匹配突出末端的DNA片段連接。目前，本段描述的3種直接克隆的載體都沒有實現商品化，在文獻報道中該方法也應用得不多。因此，很難對這幾種直接克隆方法是否相對成功或者其桿狀病毒骨架能否廣泛用于制備桿狀病毒表達載體作出評估。
除解決關于重組桿狀病毒載體構建的早期技術難題外，一些對親代桿狀病毒基因組進行改進的目的是增強重組載體上外源蛋白的表達。基本的做法是刪除這樣的一些桿狀病毒的基因:①已知這些基因對病毒在培養的昆蟲細胞中的復制是不需要，暫且定義為「附屬」(accesSory)基因;②認為這些基因通過某些方式干擾了外源蛋白的產生或降解目標蛋白質。此類桿狀病毒DNA是最初由Bishop和同事們研發出的線狀病毒DNA，后來被Novagen商品化為BacVector-2000。除多角體蛋白外，這種病毒DNA還缺少其他5種未公開的附屬基因。缺失這些基因對于外源蛋白產量的影響一直都不清楚，因為沒有相關報道用這些基因缺失與否的桿狀病毒DNA進行外源蛋白表達量的對比研究。
接著, 另外兩個非必需基因: 一個編碼幾丁質酶（Hawtinetd.，1995), 另一個編碼組織蛋白酶樣蛋白酶(cathepsin-likeprotease)(Slacketal.，1995) 在BacVector-2000被剔除，所形成的以AcMNPV為基礎的親代病毒DNA被稱為BacVector-3000(Nova-gen)。其他的以AcMNPV為基礎并缺失了病毒幾丁質酶和組織蛋白酶樣蛋白酶基因的病毒包括一種被稱為BestBac(表達系統)的商業化的桿粒和一種未商業化的稱為八出扣-DCC(Kabaetal.，2004)的經修飾的桿粒。flashBACtm系統中使用的桿粒同樣缺少有功能的幾丁質基因。親代病毒上幾丁質酶和組織蛋白酶樣蛋白酶的缺失對重組桿狀病毒載體的子代病毒的外源基因表達的影響并不是完全清楚，但還是有一些資料可以參考。
其中一項研究表明，缺失這兩種酶的AcBacDCC表達的一個外源糖蛋白比含有這兩種酶的桿狀病毒載體表達的糖蛋白更不容易降解(Kabaetal.，2004)。這似乎與預期是一致的，刪除病毒蛋白酶基因通常會促進重組蛋白和分泌蛋白更好地表達。但是, 還需要做更多的工作來確定剔除某個特定的蛋白酶基因是否會廣泛的影響外源蛋白在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中的生產。目前還比較少觀察到刪除病毒幾丁質酶基因的潛在影響。曾有研究顯示, 病毒幾丁質酶駐留在內質網上，它通過飽和宿主蛋白轉運機器來干擾分泌途徑蛋白的產生(Kabaetal.,2004)。如果上述機制是事實, 那么刪除病毒幾丁質酶基因從而達到沒有幾丁質酶的目的, 這樣可能會增加分泌蛋白的表達水平。但是，目前還沒有公開出版的研究證明單獨刪除以AcMNPV為基礎的載體, 如flashBAC上的幾丁質酶基因所產生的影響。研究顯示，缺失了幾丁質酶的AcBacDCC表達的外源蛋白降解減少, 但該病毒同時缺失了組織蛋白酶樣蛋白酶，這使得結果的解釋變得復雜化。另外，已有一篇出版的文獻顯示單獨或全部剔除重組絲蟲桿狀病毒(recombinantsilkwormbaculovirus)的幾丁質酶或組織蛋白酶樣蛋白酶基因對外源蛋白生產的影響[家蠶核型多角體病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,(BmNPV)，Leeetal.，2006]。在這個系統中，編碼昆蟲纖維素酶(Cellulase)的重組BmNPV載體在刪除幾丁質酶或組織蛋白酶樣蛋白酶基因時在蠶中表達的外源蛋白具有更高的水平和更好的酶活性。而且，用缺失這兩種病毒酶基因的載體可以獲得具有最高酶活性、最高表達量的纖維素酶。你會推測這些結果顯示從AcMNPV為基礎的載體刪除病毒幾丁質酶基因會有類似的效果。但是，由于在這個研究中是以蠶（silkworm)而不是以昆蟲細胞系作為宿主, 這種推測的合理性會被削弱。
DiamondBac是另一個通過刪除非必要基因在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中增強重組蛋白表達量的親代桿狀病毒DNA的例子。如上所述，DiamondBac是與BakPAK6類似的商業化的、預先線性化的桿狀病毒DNA，但是這種病毒DNA還缺少有功能的WO基因，有研究顯示，該基因與宿主細胞的裂解有關（WilliamsetaL，1989)。因此，制造商的商業文獻指出，用該親代病毒產生的重組桿狀病毒載體感染的細胞會在感染過程中一直保持較高的細胞活性，這會有助于提高重組蛋白的表達水平（Sigma-Aldrich,2008)。
DmmondBac的另一個讓人感興趣并有潛在用途的特點是，在桿狀病毒基因組中的W0基因被蛋白二硫化物異構酶（proteindisulfideisomerase，PDI)基因替代，該基因編碼的一種伴侶蛋白能夠促進二硫鍵的形成并有助于蛋白質的折疊。已有公開出版的證據表明，在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中共表達PDI, 可以提高重組IgG的可溶性和分泌水平(Hsuetal.，1996)。Sigma-Aldrich的商業文獻指出，WO基因的缺失以及PD7基因的插入可以將多數重組蛋白的總產量提高接近10 倍。但是，沒有公開發表的研究對重組桿狀病毒載體有無WO基因缺失或PDI基因插入情況下外源蛋白的生產水平進行比較。
因此，在最終的分析中, 為了直接確定非必須病毒基因，如病毒的幾丁質酶基因、組織蛋白酶樣蛋白酶基因和朽o基因的缺失對在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中進行蛋白質生產的總體影響, 需要對合適匹配的AcMNPV來源的載體進行直接比較研究。
除了DiamondBac親代桿狀病毒DNA外, 已有文獻報道有人設計出插入了編碼外源蛋白加工酶基因的桿狀病毒載體，以此來提高外源蛋白的產量。這之中就有一個重組桿狀病毒載體具有在P]0啟動子控制下的多分 DNA 病毒(polydnavirus)wai^yri77基因(Fath-Goodinetal.，2006)。已經發現某些基因的表達產物可以延長被桿狀病毒轉染的 Sf9 細胞存活時間，這相應的就能夠提高在多角體蛋白啟動子控制下共表達的外源蛋白的產量。其他可以歸為此類的桿狀病毒載體包括具有在桿狀病毒id啟動子調控下的外源糖基轉移酶（glycosyltransferase)基因（Jarvisetal.，2001;Tomiyaetal.，2003)或與磷酸胞苷唾液酸（CMP-sialicacid)生物合成相關的酶的基因（Hilletal.，2006)的載體。在載體中使用早期啟動子, 可以在感染的早期表達這些具有加工功能的蛋白質，使其表達遠遠早于外源蛋白的表達。這就使得昆蟲細胞的內源性N-糖基化功能得到延伸，在目標糖蛋白開始表達之前就具有了對蛋白質進行人源糖基化的能力。
一種轉移質粒可以同時將多分 DNA 病毒基因和外源蛋白的基因引入到桿狀病毒基因組中，Paratechs已將這種質粒商品化。類似的，在不久的將來，具有更高級真核iV-糖基化功能的親代桿狀病毒DNA會被商業化并用于制備重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的出現會使對這些類型的病毒載體增加蛋白質表達水平的能力或生產人源化糖蛋白的能力進行全面評估變得更加方便。目前, 未曾使用大量的外源蛋白/糖蛋白對這兩方面的能力進行過評估。
考慮到目前為止本章的重點都放在了桿狀病毒表達載體上，很有必要提醒讀者，桿狀病毒-昆蟲細胞系統是一個由兩個部分組成的二元系統。當然，第一個部分就是桿狀病毒表達載體，它是一個昆蟲病毒，其功能顯然就是將編碼目標蛋白質的外源基因導人宿主細胞中。桿狀病毒表達載體的另一個功能是為在晚期或極晚期啟動子控制下的目標基因的轉錄提供所需的轉錄復合物。第二個部分就是到目前為止幾乎沒有提及的宿主，通常是鱗翅類昆蟲細胞系，但有時是鱗翅類的昆蟲。
鱗翅目昆蟲(OrderLepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶（butterfly)，它們是桿狀病毒家族中多種病毒(包括AcMNPV)的宿主。Grace在1%2年第一個建立了鱗翅類昆蟲細胞系(Grace,1962)。至今，已經建立了超過250種昆蟲細胞系（Lynn,2007)。但是, 我們重點關注兩個桿狀病毒表達載體最常用的鱗翅類昆蟲細胞系。其中一個是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亞克隆IPLB-SF-21而建立的，IPLB~SF-21細胞系是在1977年從草地貪夜蛾(Spodo卿ra/rwgipenia, 又稱為秋天行軍蟲）的卵巢組織中分離出來的 Sf9 細胞可以在很多商業公司購買到，如Invitrogen和Novagen或者美國模式菌種收集中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。另外一種是HighFive, 最初是從粉紋夜蛾m’，又稱為甘藍銀紋夜蛾(cabbageIooper)]的成熟卵巢組織中分離到的細胞系，在1992年由Granados和Wood的小組稱為BTITn5B-1，后被Invitrogen商業化為HighFive。
Sf9和HighFive兩種細胞系的一個有趣的特點是二者都能夠以貼壁或懸浮狀態生長。由于這個特點，通過感染數以百萬計的在培養板或培養瓶中生長的 Sft或 HighFive細胞，可以很方便地進行實驗室規模的蛋白質生產實驗。貼壁生長的 Sf21或Sf9 細胞也常規用于空斑篩選和重組桿狀病毒表達載體的定量。另外，Sf9和HighFive兩種細胞都能夠在轉瓶（spinnerflask)、搖瓶（shakeflask)、氣升式攪拌槽（airlift,stirredtank)、Wave生物反應器(Wavebioreactor) 中擴大規模來生產大量的重組蛋白。
昆蟲細胞培養的條件和方法與大多數研究人員所熟悉的哺乳動物細胞的培養方法大不相同。例如，培養昆蟲細胞的最適溫度是28°C而不是37°C另外，Sft和HighFive
細胞貼壁不緊, 在傳代培養時不需要EDTA或胰酶(trypsin)處理。昆蟲細胞的生長不需要含有CO2的培養箱，因為昆蟲細胞培養基是用磷酸鹽作為緩沖液而不是碳酸鹽。Sf9和HighFive細胞都可以在有或沒有血清的培養基中生長, 這兩種培養基的來源都很廣。事實上, 從1990年本書的第一版面世以來, 多種不同的昆蟲細胞培養基都能夠從多個不同的制造商那里買到，其中最主要的包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。但是，需要指出的重要一點是，Sf9和HighFive細胞會傾向于逐漸適應某種特定的培養基。因此, 突然地將Sft和HighFive細胞的培養基由有血清培養基變換為無血清培養基會導致培養細胞的損失。一個更容易成功的做法是緩慢戒除血清法。例如，在連續的4次傳代中，你可以將無血清培養基的比例從0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用這種相對緩慢的血清戒除法，當將細胞剛剛置于不含血清的培養基時，這些細胞也會經歷短暫的生長停止或生長緩慢。因此, 保持耐心非常重要，因為這些細胞會在新培養基中遲滯生長12天后恢復正常的生長速率。
緩慢血清戒除法不僅對從有血清培養基到無血清培養基的轉換有用，還可以用于將昆蟲細胞從一種無血清培養基轉移到另一種無血清培養基。