最早的鱗翅類昆蟲細胞的遺傳轉化技術出現在1990年（Jarvisetal.，1990)。那時，研發該技術的初衷在于構建一個穩定轉化的昆蟲細胞系，它旨在能夠持續生產目標重組蛋白而無需使用桿狀病毒進行感染。然而, 構建這個生產用細胞系所用的載體及方法也為構建具有新型特色的轉基因昆蟲細胞系提供了條件，這些新型細胞系將能夠更好地支持重組桿狀病毒介導的外源蛋白的生產。第一個進行宿主細胞改造的案例是要解決本章前面提出的一個問題, 即桿狀病毒-昆蟲細胞系統能夠進行真核蛋白加工，但這種加工與更高等真核細胞對蛋白質的加工并不總是相同。對于這個局限，大家了解最多的一個例子是Sft和HighFHve細胞都能夠對新合成蛋白質進行N-糖基化, 但其對JV連接的糖鏈(〗V-聚糖)[參考Harrison和Jarvis(2006;2007b),Shi和Jarvis(2007)的綜述]的加工卻達不到哺乳動物細胞那樣的程度。第一個從改造細胞的角度來解決這個問題的方法是使用在AcMNPVid啟動子調控下的牛/M，4-半乳糖基轉移酶（bovine片1，4-galactosyltransferase)cDNA轉化Sf9 細胞（Hollisteretal.，1998)。該cDNA編碼Sf9 細胞中沒有的N-聚糖加工酶，導人該酶的目的是使Sf9 細胞的內源蛋白加工能力得到擴充，這樣轉基因細胞系生產的iV■糖基化糖蛋白的JV-聚糖就可以經過進一步的加工，更接近于人源iV-聚糖。確實，最終得到的命名為S_GalT的細胞系具有該酶的編碼序列，并能夠組成型表達這個哺乳動物基因，這使它具有了親代細胞系不具備的能力: 生產具有部分人源 N-聚糖結構的外源糖蛋白。但這僅僅是對細胞進行改造的第一步，因為需要對Sf9 細胞蛋白質N-糖基化途徑進行進一步的人源化，而這需要「敲人」更多的其他哺乳動物功能基因。總的來說, 可以通過構建W啟動子驅動下的編碼其他功能的哺乳動物基因，然后用其生成另外的轉基因 Sf9 細胞亞克隆來完成這個任務（Aumilleretal.，2003;HollisterandJarvis，2001;Hollisteretal.,2002;Seoetal.,2001)。所構建的每個細胞系都能夠支持桿狀病毒的復制和桿狀病毒介導的外源基因表達，同時也能夠組成型地表達所轉入的哺乳動物基因。最終，每一個這種轉基因的昆蟲細胞系較其親代Sf9 細胞具有更深入的N-聚糖加工能力，能夠產生具有更接近人源JV-聚糖糖基的糖蛋白。HighFive細胞也有類似的轉基因細胞系，它們轉入了在id啟動子控制下的兩種不同的哺乳動物糖苷轉移酶的基因（BreitbachandJarvis,2001)。Invkrogen已經將一個最初命名為SfSWT-I的源于 Sf9細胞的轉基因昆蟲細胞系商業化，其商業名為MIMIC, 該細胞系具有更深入的N-糖基化途徑，在含有血清的培養基中生長時能夠表達出人源化的重組糖蛋白。在不久的將來，具有很多哺乳動物基因的更髙級的昆蟲細胞系會被商業化，這樣的細胞系能夠在不含血清的培養基中生產具有唾液酸化末端糖基的糖蛋白（Aumilleretal.>2003)。另有一種很有希望作為改進的桿狀病毒表達載體宿主細胞的轉基因鱗翅類昆蟲細胞系衍生于 Sf9細胞，它轉人了立即早期桿狀病毒啟動子控制下的多分DNA病毒 Wznbrin 基因(Fath-Goodinetal.,2006)。就像上面討論的那樣，桿狀病毒介導的多分DNA病毒 mMyhn 基因的表達可以使桿狀病毒感染的Sf9細胞活的更長，從而增加了在多角體蛋白啟動子控制下的共表達的外源蛋白的產量。同樣的道理，一個經過工程改造能夠組成型表達基因的轉基因Sft 細胞系具有更長的壽命，感染攜帶黃色熒光蛋白基因的重組桿狀病毒后能夠以更高水平表達黃色熒光蛋白（Fath-Goodinetal.,2006)。ParaTechs公司已經將 3種不同的衍生于 vankyrin-enhanced(VE)Sf9的細胞系進行了商品化。
目前已經有了 MIMIC 和 VE 細胞系, 將來會出現別的同樣類型的轉基因昆蟲細胞系，它們的出現能夠允許研究人員對這些細胞系生產人源化糖蛋白的能力和提高重組蛋白表達水平的能力進行更加全面的分析。這樣的分析很重要，因為這兩種類型的經過改進的桿狀病毒表達載體的宿主都沒有使用大量的不同外源蛋白 Z 糖蛋白對其進行廣泛的評估。事實上，已有關于 MIMIC(SfSWT-I) 細胞不能夠將一種特別的外源糖蛋白，馬的黃體生長激素/域毛膜促性腺激素（equinelutenizinghormone/chorionicgondotropin)(LegardinieretaL，2005) 唾液酸化的報道。這兩種馬的糖肽類激素是由相同的基因編碼的，因而有相同的氨基酸序列。根據對天然產物（Smithetal.，1993)N-連接糖蛋白特征的分析，你會預期 MIMIC(SfSWT-l) 細胞產生的重組激素在末端有 a2,3-連接的唾液酸殘基。因此，:Legardmier 與他的同事獲得的結果很可能反映了 MIMIC(SfSWT-1) 細胞不能對馬的促黃體生長激素/絨毛膜促性腺激素進行 a2，3-連接形式的唾液酸化，之前從未對該細胞的這種能力做過評價。事實上，最近我們發現, 盡管 MIMIC(SfSWT-1) 細胞編碼并表達鼠的 a2,3-唾液酸轉移酶 U2，3-sialyltransferase), 但卻未檢測出細胞中有該酶的活性 (數據未給出）。現在清楚了 MIMIC(SfSWT-l) 細胞不具有對所有目標外源N-糖基化蛋白進行唾液酸化的能力。研究人員正在嘗試構建新的細胞系，它可以進行 a2,6-和a2,3-唾液酸化。但是，一種具有 a2,3-唾液酸轉移酶活性的新轉基因昆蟲細胞系也有可能不能唾液酸化所有的目標糖蛋白。而且，如果在 VE 細胞和其他的作為桿狀病毒表達載體改進的宿主的轉基因細胞系中都出現這種局限, 不要感到驚訝。
本書第一版的第 10 章中就已經包含了許多重要的關于桿狀病毒轉移質粒構建、昆蟲細胞培養、桿狀病毒表達載體的生產、分離和鑒定的較為詳細的操作方案，還有在桿狀病毒-昆蟲細胞培養體系中表達重組蛋白所需的分析方法 (Bradley,1990), 這些至今仍然可以使用。此外，也相繼出版了大量有關桿狀病毒-昆蟲細胞培養體系的書籍，這些書籍或其章節都有詳細的技術方案（KingandPossee,1992;Murhammer，2007;O’reillyetal.，1992;Richardson，1995;SummersandSmith，1987)。最后指出，對于本章中提到的那些為便于制備和分離重組桿狀病毒表達載體而構建的新型桿狀病毒轉移質粒和桿狀病毒基因組骨架，每個構建者都提供了詳細的圖譜、序列和使用所需的分步操作方案，這些都可以從他們的網站免費得到。相應地，我也選擇了一些在我們實驗室使用的, 相對小型的，但都是必須的一套經過數次檢驗的技術方案和大家分享, 這些技術方案來源于 Summers和Smith(1987)及 O7ReiUy 等(19)編寫的桿狀病毒使用者「手冊」，但在某些部分，根據我們的需要進行了適當地改良。對于本章提到的任何具體方法，轉移質粒和親代桿狀病毒載體，讀者可以參考下面給出的來源去獲取有關的直接詳細信息, 此處就不再進行復述了。
我們通常在125 mL 的DeLong 搖瓶（Bellco) 中培養 50 mL 的Sf9細胞培養物，不論使用有血清或無血清培養基。對于有血清培養, 我們使用添加了 10%(V/V) 胎牛血清 (HyClone)和 01% 聚醚 F68(pluronicF68)(Sigma-Aldrich)的 TNM-FH 培養基；對于無血清培養，我們使用 ESF921(表達系統）。在我們的細胞培養中，我們既不將胎牛血清進行熱滅活，也不在培養基中添加抗生素，因為使用我們的標準共挑選方法(standardcoselectionapproach) 進行轉基因亞克隆的構建時，它們會產生干擾（HarrisonandJarvis，2007a;JarvisandGuarino,1995)。在每周的周一、周三和周五, 我們將培養的細胞傳代，在周一和周三，Sf9細胞的接種密度為 0.5X106 個細胞/mL, 在周五為 0.3X106 個細胞/mL。使用標準的臺盼藍染色排除法在血細胞計數器上檢測細胞密度（Murhammer,2007)。在搖瓶培養中 Sf9細胞的活力應維持在較高的水平，其倍增時間應在 24 h 左右。
對于更大量的細胞, 其培養可進行如下放大:100 mL 的細胞在 250 mL 的DeLong 搖瓶中進行培養，200 mL 的細胞在 500 mL 的DeLong 搖瓶中，或者 800 mL 的細胞在 2.8L 的 Fembach 瓶子(Bellc0) 中培養。轉基因的昆蟲細胞系的接種密度各有不同，通常均高于Sf9細胞的接種密度。在我們最近的實踐中，以與 Sf9細胞相同的接種密度接種轉基因的昆蟲細胞系，它們的生長會變慢并且/或者經歷一個暫時的停滯，之后再開始以正常速率生長。
除非你可以一直購買商業來源的已經純化過的病毒DNA，因為分離出足夠純度的桿狀病毒基因組DNA是制備重組桿狀病毒表達載體的一個重要方面。采用差速離心方法，我們可以從芽生病毒(buddedvirus)中分離出病毒DNA。使用合適的親代病毒感染 S9細胞，為避免缺失性干擾粒子（defectiveinterferingparticle)的產生（Kooletal.，i9；n)，應使用較低的感染復數 (如 o.Oi 空斑形成單位/細胞）。如上所述，采用加有胎牛血清和普朗尼克(pluronic)F68 的 TNM-FH 培養基培養細胞 3~5 天，并在相差顯微鏡下監控細胞的病理學征兆。一旦觀察到明顯的感染跡象，立即將感染的細胞在無菌的條件下轉移到一次性使用的離心管中，大約 1000ul 離心 15 min。將澄清的上清液轉移到超速離心管（如 33 mL 的BeckmanSW28 離心管）中，之后將含有 5 mmol/LNaCl和 10 mmoI/LEDTA的 25%(m/V) 蔗糖溶液小心地加入離心管底部 (如 3 mL 的BeckmanSW28 離心管）。再將離心管以 4°C, 大約 100000 g 離心 75 min(如對于 BeckmanSW28 轉子，可采用 28000r/min)，之后，將上清液傾出，留下芽生病毒的沉淀塊。使用藍色槍頭 (剪掉尖端，以具有較大的口徑) 加入一定量的裂解緩沖液 (每毫升的初始感染性病毒培養基中加入 0~ImL) 溫和重懸病毒沉淀，裂解緩沖液的組成為 10 mmol/L Tris(pH7.6)、10 mmol/L EDTA 和 0.25%(m.V)SDS。然后向其中加人蛋白酶 K(10 mg/mL, 溶于水）至終濃度為500jug/mL, 將其置于 37°C 孵育，間或旋轉，直至溶液變得澄清, 這個過程通常需要 4 h 到一整夜。如果溶液仍是比較渾濁的, 那么應加入更多的裂解緩沖液和蛋白酶 K。將所得溶液依次釆用苯酚和苯酸-氯仿進行溫和的抽提，之后，在0.3mol/L 乙酸鈉存在下通過乙醇沉淀病毒DNA。最后, 使用 TE 重懸 DNA 沉淀 (相對每毫升的初始培養物加入 10fxL 的 Tris-EDTA 緩沖液進行重懸)。重懸的病毒DNA 濃度可采用分光光度計進行估測，但是，我們發現其非常不可靠。所以，我們一般通過對比法來使該估值更精確: 使用 Ec0RI 或Hhdin 消化 10 的病毒DNA，然后將消化產物與已知濃度的商業化 DNA分子質量標準進行瓊脂糖凝膠電泳，接著以溴化乙錠或其他 DNa 染色方法染色。應該注意的是，這種方案與 o，Reilly 與其同事（O’reillyetal.，1992)在桿狀病毒表達載體使用手冊中所描述的方案在本質上是一樣。
總的來說，空斑分析是病毒學的一個重要方面。它是確保重組病毒以單一克隆形式被分離出來的最佳方法。進行空斑分析的準備工作包括兩個互相獨立的步驟:①在培養皿中預接種指示細胞;②將病毒儲存液進行一系列的 10 倍梯度稀釋。如上所述, 我們使用在搖瓶中培養的處于對數期生長期的S9細胞進行接種, 該細胞的生長培養基為含有 10% 胎牛血清和 0.1% 普朗尼克 F68 的 TNM-FH。將所需數目的細胞溫和離心后丟棄舊的培養基，然后使用新鮮的無添加物的 TNM-FH 重懸細胞, 最后將細胞以 0.75XIO6個細胞/孔的密度接種于 6 孔細胞培養板 (corning)。在 28°C 下 I 障育 Ih 以使細胞沉降并貼附于培養板的塑料內壁。相對于培養基中有血清時，培養基中無血清時細胞會更加緊密地附著于培養板。在細胞進行貼壁時，可以將病毒儲備液進行一系列的 10 倍梯度稀釋，該稀釋建立在一個假設之上，即病毒儲備液具有的噬斑實驗滴度為IXlO7pfu/mL。
我們采用含有胎牛血清和普朗尼克 F68 的 TNM-FH 作為稀釋液，0.ImL 的病毒液加人 9.9 mL 的稀釋液后為 100 倍的稀釋,0.5 mL 的病毒液加入 4.5 mL 的稀釋液后為 10倍的稀釋。設置好空白稀釋液后在無菌的條件下進行稀釋，每次轉移溶液后采用渦旋混合器混勻。在完成稀釋和細胞已經貼附于培養板后進行細胞接種，每個稀釋度接種兩個細胞孔。將細胞孔中的培養基移除后每孔加入 2 mL 的病毒稀釋液。這是該實驗中的關鍵步驟，因為細胞會很快干掉，如操作太慢, 培養皿邊緣的細胞將會死亡。所以，每次最好只移除兩個孔的培養基，并立即加人相同濃度的病毒稀釋液，然后，再進行下一對細胞孔和下一個稀釋濃度的操作。我們一般采用 10_5、10—6 和 10_7 的病毒稀釋度進行感染，以便于得到合理數目的空斑用于計數。再將病毒與細胞置于 28°C 孵育 Ih 以使病毒吸附于細胞，這期間應同時制備覆蓋培養基 (overlaymedium)。我們準備了一個 125 mL 的瓶子，瓶子裝有 50 mL2%(m/V)的溶于水的Seaplaque 低熔點瓊脂糖 (Cambrex), 將該瓶進行高壓滅菌, 隨后使瓊脂糖凝固。所得的瓶裝固態瓊脂糖可以采用微波處理使其再次融化, 之后冷卻到大約 60°C 與等體積的已經預熱到 30°C 的 2XGrace、培養基 (每孔需要 3 mL) 混合。如果使用藍、白斑篩選來幫助鑒定假定的重組病毒，那么，此時應將顯色底物加入覆蓋培養基中。接著將覆蓋培養基進行渦旋混合以獲得均勻的混合物，再冷卻至 40~42°C。最后，將感染的細胞從孵育箱取出，使用移液管徹底吸出病毒接種物，并將 3 mL 的覆蓋培養基從孔的邊緣緩慢地加人到培養孔。同樣的，每次先吸出 2 個孔的病毒接種物，再相應加人覆蓋培養基，之后進行下一組的操作，避免細胞脫水和死亡。放置 15 min 以使覆蓋培養基變硬, 將培養皿置于封閉的塑料袋中，顛倒后于 28°C 孵育 7~10 天。使用解剖顯微鏡觀察空斑并仔細計數, 使用所得的空斑數、稀釋倍數及感染體積來計算原始病毒儲存液的滴度。