糖 基 化 是 真 核 細 胞 中 最 常 見 的 蛋 白 質 翻 譯 后 修 飾 。寡 糖 通 常 連 接 于 天 冬 酰 胺 側 鏈(iV-連 接 糖 基 化 ) 或 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸 羥 基 側 鏈 (〇 連 接 糖 基 化）。凝 膠 中 蛋 白 質 電 泳 后 染色 時 ，通 常 先 用 高 碘 酸 氧 化 鄰 近 的 糖 基 ，然 后 根 據 希 夫 堿 機 制 進 行 酰 肼 結 合 。
顯 色 ：酸 性 品 紅 染 色 劑
市 面 上 可 以 買 到 的 試 劑 盒 都 是 基 于 一 種 利 用 酸 性 品 紅 染 色 劑（Zzcharius et al. ，1969) 的 顯 色 方 法 ，包 括 G e l c o d e ( T h e r m o Scientific) 和 Glyco-P r o (Sig m a-Aldricli) 糖蛋白染 色 試 劑 盒 。凝 膠 在 5 0 % 甲 醇 中 固 定 、清 洗 ，并 在 1 % 高 碘 酸 鹽 中 孵 育 從 而 氧 化 鄰 近 的 糖基 ，再 清 洗 ，用 品 紅 亞 硫 酸 鹽 試 劑 孵 育 ，在 還 原 劑 (偏 亞 硫 酸 氫 鈉 或 硼 氫 化 鈉）中 孵 育 ，清洗 ，再 保 存 在 稀 乙 酸 中 。糖 蛋 白 指 示 通 過 品 紅 條 帶 完 成 ，品 紅 條 帶 在 染 色 反 應 進 行 時 開 始出 現 ，隨 后 顯 色 緩 慢 增 強 。
熒 光 通 用 糖 蛋 白 染 色 劑
Pro-Q E m e r a l d 300 和 P r o - Q Emerald 488 糖 蛋 白 凝 膠 染 色 試 劑 盒（Life Technologies; 數 字 表 示 各 自 的 常 用 激 發 光 源）、K r y p t o n 糖 蛋 白 染 色 試 劑 盒（T h e r m o ScientificPierce) 和 Glycoprofile III 熒 光 糖 蛋 白 染 色 試 劑 盒（S i gma-Aldrich) 均 是 利 用 高 碘 酸 鹽 氧
化 后 與 熒 光 酰 肼 結 合 而 進 行 染 色 。使 用 這 些 試 劑 盒 時 , 不 需 要 進 行 后 續 的 還 原 反 應 (如 和偏亞硫酸氫鈉進行還原反應）。
大 多 數 可 買 到 的 熒 光 酰 肼 都 有 自 發 熒 光 。亮 綠 熒 光 的 P r o - Q Em e r a l d 3 0 0 酰 肼 試 劑在 溶 液 中 不 顯 熒 光 , 在 同 小 分 子 醛 結 合 時 就 顯 弱 熒 光 性 。染 色 后 的 糖 蛋 白 條 帶 是 亮 綠 色的 ，結 合 后 的 染 料 可 作 為 成 核 位 點 使 溶 液 中 濃 度 接 近 飽 和 的 自 由 試 劑 沉 淀（H a u g l a n det al. ，2005)。 P r o - Q Emerald 3 0 0 和 P r o - Q E m erald 4 8 8 糖 蛋 白 染 料 試 劑 盒 的 使 用 已 有— 些 細 節 方 面 的 討 論（Hart et al. ，2003;Steinberg et aL ,2001)。這 些 研 究 發 現 了 P r o - QE m e r a l d 3 0 0 糖 蛋 白 染 料 是 最 靈 敏 的 選 擇 性 糖 蛋 白 染 料 ，在 使 用 時 卻 只 適 用 于 紫 外 線 光源 。研 究 中 的 數 據 和 觀 察 結 果 都 突 出 表 明 ，許 多 熒 光 酰 肼 會 顯 示 總 蛋 白 質 的 非 特 異 染 色 。此 外 ，染 料 稀 釋 液 組 分 也 會 影 響 其 選 擇 性 。通 過 選 擇 那 些 已 經 充 分 了 解 其 特 性 的 蛋 白 質
和 /或 通 過 糖 苷 酶 消 化 后 的 樣 品 ，以 此 作 為 含 有 蛋 白 質 的 已 知 糖 基 化 狀 態 的 對 照 ，在 待 測樣 品 電 泳 時 將 其 作 為 對 照 泳 道 是 很 有 幫 助 的 。未 經 高 碘 酸 鹽 氧 化 的 平 行 膠 也 許 可 以 指 示固 有 的 非 特 異 蛋 白 質 染 色 ，或 是 由 于 其 他 氧 化 反 應 而 造 成 的 內 源 醛 或 酮 的 染 色 。最 后 需要 注 意 的 是 ，通 過 突 光 掃 描 儀 可 以 檢 測 出 酸 性 品 紅 亞 硫 酸 鹽 染 色 的 蛋 白 質 條 帶 。掃 描 儀
需 532 n m 激 光 和 675 n m 長 通 過 濾 鏡 ，比 起 可 見 的 色 度 法 極 限 ，其 敏 感 度 增 加 2?4 倍 。
疊氣化物-炔烴” 點 擊 化 學 “試劑
許多蛋白質經 N -乙酰氨基葡萄糖 (O G l c N A c ) 以 P-連接方式 O 型連接到絲氨酸和蘇氨酸殘基上，從而獲得顯著的修飾。這種翻譯后修飾體現了可控方式下磷酸化作用的位點特異的相互性。因 此 O O l c N A c 糖基化可能扮演一種動態「陰-陽」角色 ，介 導磷酸化調節的信號，以及其他特異的蛋白質信號 (Golks and Guerini，2008;H a r t ，1999)。從歷史上看 ，基于凝膠的 O G l c N A c 檢測仍有一定問題，但如今已經可以實現用于凝膠檢測的敏感的 O G l c N A c 特異熒光標記。
這一方法是基于銅 (I) 催化的疊氮化物和炔烴間的 H u i sgen [ 3 + 2 ] 環加成反應，是一種 「點擊化學」反 應（A g n e w et al. ，2 〇 08;Clark et al. ,2008)。 蛋白 質 （于純化的任意階段 ) 經 Click-iT O G l c N A c 酶標系統 (Life Technologies) 酶促標記 (4 〇 C 過夜），這種標記使用的是一種允許條件下的突變 型 浐 I ，4-半乳糖基轉移酶 (Gal-Tl Y 289L ) ，這種酶可以將U D P -半乳糖中的疊氮化物修飾的半乳糖 (G a I N A z ) 轉移到目標蛋白質的〇 型 JV-乙酰氨基葡萄糖殘基上（Ramakrishnan and Q a s b a , 2 〇〇 2 )。 疊氮化物修飾的 O G IcNAc 糖基化的蛋白質隨后經銅 (I) 催化的點擊反應被熒光標記，該反應使用的是四甲基羅丹明-炔烴(T A M R A -alkyne) 或 Dapoxyl 炔 烴 染 料 ，染 料 各 自 為 CUck-It T A M R A 或 Click-iTD a p o x y l 蛋白質分析檢測試劑盒 （Life Technologies) 中的催化試劑。被標記的蛋白質經S D S -P A G E 被 分 離 , 再通過適當儀器進行圖像采 集 。 酶標試劑盒含有一種陽性對照蛋白質 w 晶型。該 技 術 已 被證明可利用 T A M A R 炔烴檢測試劑來檢測微型凝膠中的 1 〇?40u mol 的 O G IcNAc，并且可與下游的質譜分析相兼容。被標記的蛋白質同樣可以用總蛋白質染色劑或其他翻譯后修飾—特 異 的 染 色 劑 （如 P r o - Q D i a m o n d 磷蛋白染色劑或
P r o —— Q Emerald 3 0 0 糖蛋白染色劑) 染色。