3. 方法
此處列出的方法概括了為定點突變而做的氨基酸位點選擇（見 3.1)、為在細菌細胞中表達而做的 MutH 蛋白突變 （ 見 3.2 ) 和 MutH 變體的鑒定（見 3.3 )。
3.1 為定點突變對氨基酸的選擇
從生物技術信息國家中心基因組基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST) 頁面（ http : //www. ncbi. nlriLnih. gov /BLAST/) [ 24 ] 得到 MutH 蛋白和相關限制性內切核酸酶的序列。更多的序列從 PSI BLAST 服務器 [ 25 ] 得到。使用 PAM250 矩陣，用 ClustalX 程序比對序列。比對好的序列用 GeneDoc 程序分析 [27] 。程序的使用方法可在程序內使用 “Help” 功能得到。結構的坐標從 PDB 數據庫（http : //www. rcsb . org/pdb/ ) 得到。程序 RasWin 和 Swiss PDB viewer 用于結構觀察。
3.1.1 與 DNA 結合有關的保守殘基團的辨別
在序列比對（如用 ClustalW 或 ClustalX) 之后，完成下列步驟。
( 1 ) 將比對結果輸入 GeneDoc 程序（見 2.1；參考文獻 [27])。
( 2 ) 用 “Group” 功能將序列分組（如一個組包含 MutH，而另一個組包含限制性 ( 切核酸酶)。
( 3 ) 鑒別組特異的殘基（見注 1)。
( 4 ) 用 GeneDoc內的 “RasMol Script Dialog” 功能，生成 RasMol 執行文稿，以將組特異殘基映射入（標記在）MutH 蛋白結構中。
( 5 ) 將 MutH 結構載入 RasMol 程序（見 2.1；參考文獻 [ 28 ] ) ，在 “RasMol Command Line” 用 “Script” 命令執行從 GeneDoc 輸出的文稿，以觀察組特異殘基。
( 6 ) 辨別位于假設為 DNA 結合位點的候選殘基。
3.1.2 辨別接觸特定堿基的殘基
( 1 ) 下載限制性內切核酸酶與 DNA 底物（或產物）形成復合物的現有序列。
( 2 ) 運行 Swiss PDB viewer，以 3 個催化殘基（如 MutH 的 D70、E77 和 K79 ) 的主鏈原子為種子，將限制性內切核酸酶結構與目標 MutH 結構進行匹配。
( 3 ) 用 “Improve fit ” 功能增強擬合效果。
( 4 ) 將重疊結構的坐標輸出到電子制表程序。
( 5 ) 計算目標蛋白（如 MutH ) 的任意原子到重疊結構中堿基的距離，此堿基對應于目標蛋白中的目標堿基。
( 6 ) 對所有重疊結構，重復這些步驟。
( 7 ) 計算平均距離，并辨認對感興趣堿基距離最近的殘基。
( 8 ) 將結果與組特異殘基分析比較。
( 9 ) 為定點突變選擇有希望的殘基。
3.2 MutH 變體定點突變
MutH 變體的克隆，采用如 Kirsch 和 Joly 所述 [29] 修改過的 QuikChange 操作規程 (Stratagen)，用質粒 pMQ402 ( 來自 Dr. M.G.，University of Massachusetts Medical School，MA ) 為模板，以及兩個寡聚脫氧核苷酸用于突變以適合于產生長度在 50~500 bp 的 PCR 產物（見注 2)。
3.3 MutH 變體的純化和鑒定
為了適合于體外測試，MutH 變體必須得到純化。
3.3.1 從細菌細胞純化 MutH 變體
( 1 ) 用細菌質粒以標準分子生物學方法轉化 XL-1 Blue MRF 細胞。
( 2 ) 將細胞平鋪在含有氨芐青霉素的 LB 培養板上，于 37°C 過夜培養。
( 3 ) 選一單菌落，在 500 ml 含 75 μg/ml 氨芐青霉素的 LB 培養液中，于 37°C 生長。
( 4 ) 在 600 nm 處光密度值為 0.8 時，于 28°C，用 0.2% ( m/V ) 阿拉伯糖（終濃度）誘導 2.5 h ( 見注 3 )。
( 5 ) 以 3000 g 離心細胞 10 min。
( 6 ) 重懸細胞團于 10 ml 結合緩沖液中 [ 見 2.3 (9)]。
( 7 ) 用 Branson 超聲機，輸出級 5，占空率 50%，超聲破碎懸浮物 5 次，每次 1 min。每次超聲間歇冷卻溶液 1 min。
( 8 ) 在冷凍離心機上，以 30000 g 離心細胞碎片 30 min。
( 9 ) 于 4°C，將上清液與 Ni-NTA 瓊脂糖漿柔和地混合 30 min。
( 10 ) 將 Ni-NTA 瓊脂糖移至一空柱中。
( 11 ) 用 20 ml 清洗緩沖液沖洗該柱 [ 見 2.3 (10)]。
( 12 ) 用 0.5 ml 洗脫緩沖液 [ 見 2.3 ( 11 ) ] 洗脫。沒有必要切除 His 標記，因其不干擾內切酶活性（見注 4)。
( 13 ) 以在 280 nm 處的光密度值作為判斷依據，收集合并得到的每份蛋白質。
( 14 ) 于 4°C，用 500 ml 透析緩沖液 [ 見 2.3 ( 12 ) ] 透析樣品最少 2 h。換緩沖液 2 次。
( 15 ) 用 500 ml 透析緩沖液 G [ 見 2.3 ( 13 ) ] 透析樣品。
( 16 ) 在透析緩沖液 [ 見 2.3 ( 12 ) ] 中以 1 :10 比例稀釋樣品，測量 280 nm 處的光吸收，以便用理論消光系數計算 MutH 的摩爾濃度 [30] 。
( 17 ) 于 -20°C 保存蛋白質。
3.3.2 MutH 的切割分析
用含有未甲基化、半甲基化或全甲基化的單個 d ( GATC ) 位點（圖 7.3 ) 的 DNA 底物（用它處所描述的方法合成的寡核苷酸，或者 PCR 產物，參考文獻 [ 19 ] 和 [ 20 ] ) 來開展 MutH 和 MutH 變體的切割分析。用不同的熒光染料、（分別用 FAM 和 TET) 標記底物上下兩端的鏈，以便檢測每條鏈上的切割。
( 1 ) 10 nmol/L 濃度的 DNA 底物在 10 μl 含有 500 nmol/L 的 MutL 和濃度在 10~500 nmol/L 的 MutH 的測試緩沖液（見注 1；誤，似應為 2.4 節，第 1 條 —— 譯者） 中保溫（見注 5)。
( 2 ) 反應混合物于 37°C 溫育。
( 3 ) 以適當的時間間隔（10 s 到 30 min) 分裝反應混合物，每份含 25 fmol PCR 產物，與 12 μl 模板抑制劑（Perkin- Elmer) 和 0.5 μl Gene-Scan -500 TAMRA size standard (Perkin- Elmer) 充分混合。
( 4 ) 加熱到 95°C 2 min，并立即在冰上冷卻。
( 5 ) 在配有 47 cm ( 內徑 50 μm) 毛細管（其中含有加了 8 mol/L 尿素的 POP-4 聚合物（Perkin- Elmer) ) 的 ABI PRISM 310 基因分析儀（Perkin- Elmer) 上分析樣品。
( 6 ) 用 5 s，將樣品電注入毛細管，使用電壓 15000 V，并在 15000 V 和 60°C、使用 1X 基因分析緩沖液外加 1 mmol/L EDTA (Oerkin- Elmer) 作為電極緩沖液，使用 30 min 完成跑電泳過程。
( 7 ) 記錄切割的和未切割的熒光標記的 DNA 數量（圖 7.3 )。
( 8 ) 測定切割速度。 展開 | 