3.1 概論
3.1.1 PCA 對空間排列的要求
PCA 片段的三維朝向對于 PCA 報告蛋白是否能正確折疊至關重要，它取決于形成復合體的目的蛋白 N 端或 C 端的朝向（圖 15.1 示意了在連接設計中對空間位置的考慮）。因此，在設計蛋白一PCA 片段融合體時，以何種方式將蛋白質片段連接在一起使其能夠折疊形成天然結構是非常重要的。融合蛋白能否正確折疊受融合蛋白的末端朝向和片段間接頭（linker) 長度兩個因素的影響。我們將片段 GGGGS 應用于多種不同蛋白質，證明這個序列在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統中效果都比較好。我們認為這個序列可以改善融合蛋白的彈性和可溶性，從而有利于其組裝，而且由于此序列中不含天然蛋白酶識別位點，確保了融合蛋白的穩定性。雖然此類的接頭受到青睞，但并不表示使用它就一定能得到可以互補的片段 [ 31，32，39] 。然而，還是要避免使用諸如脯氨酸和分支氨基酸類的大的疏水和剛性氨基酸。在大多數蛋白質工程的問題中，形成復合體的目的蛋白的三維結構是已知的，因此可以設計復合體的方向并計算出所需接頭的長度。對于 DHFR PCA 來說，融合蛋白 N 端和 C 端的空間構象需求是已知的 [ 31，44 ] 。例如，如果將目的蛋白分別與F[ 1 ，2 ] 的 C 端和 F[ 3 ] 的 N 端融合，那么構建時所需的接頭就可以很短甚至不需要，因為這種構建方法已經考慮到了 DHFR 的拓撲結構；但是如果將目的蛋白分別構建到兩個片段的 N 端，要使 DNFR 能正確組裝，就必須在兩個融合蛋白之間插入至少兩個氨基酸作為接頭（每個肽鍵大約 3.75 A ) ，因為 DNFR 兩個片段 N 端的距離將近 10A。在 ras 和 RBD 的例子中就選擇了這種構建方式。然而，觀察 raf RBD 與 ras 髙類似蛋白 raplA 的復合體結構發現這兩個蛋白質的 C 端距離 40A，這就需要在每個融合蛋白中插入至少 6 個氨基酸的接頭。對于文庫篩選來說，我們將每個接頭的總長度定為 14 個氨基酸，其中包括限制性內切核酸酶位點，以確保融合蛋白具有足夠的靈活性。
3.1.2 對照和嚴密性
在利用 DHFR PCA 進行蛋白質工程研究和文庫篩選之前，必須做嚴格的對照實驗用以估計其對特定的測試系統的靈敏度和嚴密性。理想條件下，在進行文庫篩選前，實驗者應大概了解 PCA 對于一個給定的相互作用體的解離常數 Kd 的極限。不同的相互作用蛋白對有著不同的靈敏度極限（PCA 可以檢測到的最大 Kd )，但是 Kd 值又受到融合蛋白表達水平、蛋白質表達總量中可溶蛋白比例以及諸如穩定性、可溶性和蛋白質折疊、結合參數等蛋白質自身性質的影響。如果 PCA 十分靈敏，可以檢測到兩個特定蛋白質間非常弱的相互作用，它就不能在眾多的克隆中選出最好的相互作用蛋白對；也就是說，此項實驗過于靈敏從而喪失了嚴密性。因此，平衡靈敏度和嚴密性的關系至關重要。為了解決這一問題，在 PCA 實驗前通常需要做些對照實驗，雖然不是所有的這些對照都與特定的蛋白質工程研究相關，我們在后面還會再討論這個問題。
( 1 ) 偽組裝（spurious reassembly): 要使 PCA 能有效工作，應避免片段間微弱的或非特異性的相互作用。對于一個給定的相互作用蛋白對測試系統來說，PCA 有效的靈敏度可以通過對照 4 和 6 來估算。如果靈敏度過高，如長出不該有相互作用的蛋白對的菌落（圖 15.2A ) ，可以通過降低表達水平或通過對照 2 中所述的嚴密性突變來降低靈敏度（圖 15.2B)。
( 2 ) 嚴密性突變（stringency mutant)：突變 DHFR 兩片段相互作用表面上的氨基酸殘基側鏈的效果，如已報道的 F[ 3 ] 的 I114A 突變。在克隆表達通過形成亮氨酸拉鏈 ( leucin zipper) 而相互作用的蛋白對時，菌落生長速度和數量無法區分不同蛋白對間的結合效率。后來，在 F[ 3 ] 中引入突變 I114A，改變了 PCA 的靈敏度，使其可以應用于亮氨酸拉鏈系統。這種靈敏度的變化可以通過一步篩選的選擇因子（selection factor) 來衡量，選擇因子等于共轉化細胞數除以在選擇壓力下存活菌落數。數值越高嚴密性越高，所以在合理數量的重復競爭下，可以挑選出最好的相互作用亮氨酸拉鏈異源二聚體 [32]。
( 3 ) 片段置換（fragment sw apping)：無論將相互作用的兩個蛋白質分別與 PCA 系統的哪個片段融合，理論上應不影響兩個目的蛋白的相互作用。因此，置換與兩個目的蛋白質融合的片段應得到類似可比的結果。
( 4 ) 無相互作用蛋白質（noninteracting protein) : 如果已知一個蛋白質不和任何一個用于 PCA 測試的目的蛋白有相互作用，理應檢測不到 PCA 反應（圖 15.2A ) ，并且單獨過量表達這個蛋白質也不會對已知的相互作用有競爭影響。
( 5 ) 通過競爭實驗滴定和降低報告蛋白的酶活：報告蛋白的活性應隨著兩個融合蛋白表達比例的變化而改變；而且同時單獨過量表達相互作用蛋白的其中之一應減弱 PCA 反應的活性。然而，應謹記每個融合蛋白相應的可溶性和穩定性、相互作用蛋白質間的親和力對比它們的胞內濃度以及 PCA 的靈敏度都會對 titrate 報告蛋白的活性造成影響。因而可以通過降低融合蛋白的表達水平或整合對照 2 和對照 6 來調節報告蛋白的活性，從而降低互補效率。
( 6 ) 破壞相互作用：可以預測，在形成復合體的一個單體中插入特定的點突變或刪除突變破壞或減弱目的蛋白相互作用力也會影響 PCA 反應。
如果蛋白質工程項目中用于研究的模型性質已經相當清楚，那么只有對照 1、對照 2、對照 4 和對照 6 對于確定實驗的特異性和準確性是必需的。RBD-ras 的互補突變實驗及突變對親和常數 Kd 的影響已有相關報道，基于這些數據我們構建了若干突變，使 RBD-ras 相互作用的 Kd 值降低了三個數量級（圖 15.3 例子）。我們將這些突變體和其他突變體都用于 DHFR-PCA 測試，以確保這項實驗可以在 1 μmol/L 的數量級上檢測到 RBD 與 ras 的相互作用。另外，已發表的降低蛋白質穩定性的突變，如將核心區疏水氨基酸殘基（Val、Leu 或 lle ) 突變成 Ala，可以用于嚴密性測試。
3.2 合成文庫
( 1 ) 為了得到一個無偏倚的文庫，首先要構建一個模板，用終止密碼子替換基因插入區（可變區），同時插入移碼（frame shift ) 和特定的限制性內切核酸酶位點以確保其明確鑒定（見注 1)。
( 2 ) 要得到每個文庫，需要兩個部分重疊（一般 18~20 bp) 的 PCR 產物。例如，對于 PCR 反應 1，使用的一條引物與載體的啟動子區域（起始密碼子上游 120 bp，圖 15.4) 雜交互補，另一條引物與簡并靶標的 5' 段互補。對于 PCR 反應 2，需要一條雙臂引物和一條與 F[ 1，2] ( 可讀框 3' 下游 120 bp 處，圖 15.4) 雜交的引物。通常，PCR 反應程序設置如下：94°C 熱起 1 min；然后，94°C 30s，52°C 30s，72°C 30s ( 見注 2)，共 25 個循環；最后，72°C 延伸 10 min 以確保延伸完全。
( 3 ) PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用 Gelstar 和 Dark reader（見注 3 ) 觀察瓊脂糖凝膠上的 PCR 產物，這里使用的是 400~500 nm 的藍光，此波長對 DNA 沒有損傷。如果得到目的條帶，將剩余的 PCR 產物用于切膠回收。
( 4 ) 使用 QiaexTMII 純化切膠產物（見注 4 )。
( 5 ) 將來源于 PCR 反應 1 和 2 的產物約 300 ng 混合（圖 15.4 和注 5)，加入 0.2 μmol/L 的末端引物（分別與啟動子區和 F [ 1，2 ] 互補）分別與 PCR 反應 1 和 2 的 5' 端和 3' 端退火。PCR 反應 3 程序如下：94°C 熱起 1 min；然后，94°C 20s，52°C 30s，72°C 30s，共 10 個循環；最后，72°C 延伸 10 min 以確保延伸完全（見注 6 )。
( 6 ) 使用合適的限制性內切核酸酶（此例是 SphI 和 XhoI ) 酶切以上得到的 PCR 產物和載體 pQE-32△F [ 1，2 ] ( 見注 7)。
( 7 ) 純化酶切產物同第（4 ) 步。
3.3 文庫的克隆和回收
( 1 ) 插入片段和載體的理想比例是（2 : 1 ) ~（3 : 1 )。我們將用于連接的 DNA 濃度限制在 10 ng/μl，使用 1 mmol/L 的 ATP，16°C 連接過夜（見注 8 )。
( 2 ) 連接反應體系于 65°C 處理，使酶失活，用氯仿抽提，然后用乙醇沉淀，得到的 DNA 放置幾分鐘風干，最后用 30 μl 去離子水重懸。
( 3 ) 同一天還要制作 SS 320 大腸桿菌細胞株（見注 9 ) 的電轉感受態（見 15.3.8)。第（2 ) 步得到的連接產物與 300 μl SS320 細胞混合，加入至槽寬 2 mm 的電轉杯，使用 GenepulserTMII 進行電轉化。將儀器參數設定如下：2.5 kV，25 μF，200~400Ω。為了得到最好的結果，時間常數對應 200Ω 時應設為 3.8~4.5，400Ω 時應設為 7.6~9.0。脈沖后立即加入 1 ml 預冷的 SOC 培養基。將細胞轉移至 15 ml 錐形管，用 SOC 培養基洗滌電轉杯 2 次，最大限度地回收電轉細胞，細胞在 37°C 適當轉速下干 5 ml SOC 培養基中復蘇 30 min。
( 4 ) 取適量電轉細胞，稀釋 104 倍，涂平板，菌落計數，用以衡量連接和克隆的效率（見注 10)。剩余細胞加入至 250 ml 的含合適添加劑的 LB 培養基中 [ 見 15.2.2 ( 9 ) ] 培養用于提取 DNA。
( 5 ) 使用 Qiagen Midiprep Kit 或其他類似堿裂解試劑盒提取 DNA [47] 。
3.4 文庫篩選
( 1 ) 使用槽寬 1 mm 的電轉杯，將 15.3.3(5) 得到的文庫 100 ng 電轉化到 65 μl 已經攜帶有質粒 pQE-32 ras-F [3] 的 BL21 pREP4 細胞中。儀器參數：1.25~1.6 kV，25 μF，200 Ω。時間參數對應于 GenepulserTM II 時設為 3.7~4.2，對應于 Electroporator 2510 時設為 4.0~4.6。細胞在 37°C SOC 培養基中復蘇 30 min。
( 2 ) 用 PBS 洗細胞 2 次以除去 SOC 培養基。
( 3 ) 將細胞涂布于 15.2.3 ( 6 ) 所述的選擇性平板，30°C 培養 24~72 h ( 見注 12)。同時，另取出部分電轉細胞，稀釋 103 倍涂平板，用于計數和與陽性對照比較，估算轉化效率和文庫克隆的細胞存活率。例如，我們同時轉化相同量的表達野生型 RBD 與 F [ 1，2 ] 融合蛋白的載體，將電轉細胞稀釋 104~105 倍涂平板。在每一步的操作中，所有的測量都要避免文庫與野生型正對照的交叉污染。
3.5 克隆競爭實驗
改編自參考文獻 [32]。
( 1 ) 經過適當時間的培養，用少量的選擇培養基回收 15.3.4 ( 3 ) 平板中的細胞，加入到 25 ml 選擇培養基中，30°C 250 r/min 培養。
( 2 ) 培養 24 h 后，取 1 μl 飽和培養物稀釋至 2 ml 新鮮選擇培養基中。
( 3 ) 可以重復第 ( 2 ) 步直至文庫達到目標豐度。正常情況下，12 代（12 D ) 后，文庫在很大程度上得以濃縮。但是，這對于不同的系統是不同的，受到各種因素的影響，如文庫的簡并性和嚴密性突變體的使用（見 15.3.1.2)。
( 4 ) 在任何一步，都可以將飽和培養物稀釋 104~105 倍涂于選擇性平板上，以定性檢測競爭效率。隨著連續競爭的進行，菌落間的大小差異將逐步減小，菌落的平均大小將增加。
( 5 ) 在任何一代，都可以取出 10 μl 文庫加入 2 ml LB ( 100 μg/ml 氨芐青霉素，25 μg/ml 卡那霉素）培養過夜，然后使用 QIAprep 提取文庫中的克隆的 DNA ( 見注 14)。
3.6 克隆的分離與測序
以下步驟既適用于提取文庫中所含的獨立克隆的質粒，也適用于上述操作中質粒混合物的提取。
( 1 ) 從克隆庫中取出 300 ng DNA，加入限制性內切核酸酶消化，所用限制性內切核酸酶位點在 pREP4 和 pQE-32 ras-F[ 3 ] 質粒中存在，但在文庫載體中不存在。基于此目的，我們使用 Xmal、EcoNI 和 Xba l ( 見注 15)。
( 2 ) 取 1/10 的酶切產物，轉化 XL- 1 Blue 感受態細胞，取 20 μl 涂布含 100 μg/ml 氨芐青霉素的 LB 平板（見注 15)。
( 3 ) 挑菌落于含 100 μg/ml 氨芐青霉素的 LB 中培養。
( 4 ) 提取高質量的 DNA 用于測序。若操作 96 個樣品，使用 MontageTMkit；樣品數量少，適用 QIAprep column kit。
( 5 ) 我們使用只能和文庫質粒退火（如 F [ 1，2 ] 內部序列）的引物進行測序（見注16 )。
( 6 ) 測序。
3.7 蛋白質提純及其性質檢測
分析測序結果，選擇感興趣的克隆排列在 96 孔板的合適位置。此時，克隆可以轉化 XL-1 Blue 細胞，凍存作為備份。
( 1 ) 選中的克隆重新構建，只與 6X His tag 融合并表達蛋白質（見注 17)。誘導檢測 6X His 克隆的表達（見注 18)。
( 2 ) 提取正確表達的克隆的質粒。
( 3 ) 轉化 BL21 pREP4 細胞，涂布含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 25 μg/ml 卡那霉素的平板，37°C 培養過夜。若平行操作多個克隆，可以使用 24 孔板。本例中，每個轉化所用感受態細胞不要超過 20 μl，每平板最多也只涂 20 μl。涂板若超過最大允許體積，細胞將不能完全被培養基吸收。
( 4 ) 次日，挑菌落于 2.5 ml 含合適抗生素的 LB 中 37°C 培養過夜（見注 19)。
( 5 ) 以 1 :10 的比例將飽和培養物加入 25 ml 含合適抗生素的 TB 培養基中（見注 20)。
( 6 ) 加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，37°C 培養 90~120 min，收獲細胞直接提取蛋白質或 -80°C 保存（見注 21)。
( 7 ) 細胞用 1 ml Buffer A [ 見 15.2.6 ( 8 ) ] 重懸，然后重新排列在 96 孔板中（見注 22）。3200 g 離心 40 min，去除大部分不可溶組分。
( 8 ) 0.2 μm 96 孔 PVDF 板中含有 200 μl 50% 的 Ni-NTA Superflow 樹脂。將體積擴增器安裝于 0.25 mm 的 96 孔玻命纖維過濾板上方，再將此裝置安裝在真空歧管的密封塊上（見注 23)。然后，在第一個過濾板中加入 900 μl 樣品，再加入 100 μl 乙醇以減小交叉感染的風險。用大約 500 mbar 的壓力抽濾直至所有樣品全部通過此板（見注 24)。
( 9 ) 現在 PVDF 板應含有樹脂和樣品抽提物。停止抽濾，從收集器上取下 PVDF 板，安裝在真空歧管的密封塊上，然后用大約 100 mbar 的壓力抽濾直至所有樣品全部通過樹脂（見注 25)。
( 10 ) 用 800 μl Buffer B 洗 2 次 [ 見 15.2.6 (9) ]，每次真空壓力設為 500 mbar ( 見注 26)。
( 11 ) 放置好收集器，在 100 mbar 的壓力下用 100 μl Buffer E 洗脫樣品 4 次 [ 見 15.2.6 ( 10 ) 和注 26]。加入 1 mmol/L DTT 并將 pH 調至 5 ( 見注 27)。至此，樣品可以直接用于性質檢測（見注 28)。
3.8 制備 SS 320 和 BL21 pREP4 pQE-32 ras-F [ 3 ] 感受態細胞
按參考文獻 [ 48 ] 方法準備細胞。
( 1 ) 挑 SS320 或 BL21 pREP4 pQE-32 ras-F 單克隆于 5 ml LB 或 5 ml SOB 培養基中，37°C 培養 5 h 到過夜。
( 2 ) 取 2.5 ml 培養物加入至 500 ml LB 或 500 ml SOB 培養基中，37°C 300 r/min 培養到 OD600 為 0.5~0.7。
( 3 ) 冰浴 10~15 min 然后轉移至預冷的 1 L 離心瓶中。
( 4 ) 5000 g 離心 20 min。
( 5 ) 棄上清液，用 5 ml 冰水重懸菌體，加入 500 ml 冰水混勻，離心同第（4 ) 步。
( 6 ) 立即棄上清液，用剩余液體重懸菌體。
( 7 ) 再加入 500 ml 冰水混勻，離心同第（4 ) 步。
( 8 ) 立即棄上清液，用剩余液體重懸菌體。
( 9 ) 若細胞用于電轉化，將重懸細胞轉移至預冷的 50 ml 離心管，2°C 5000 g 離心 10 min。估算菌體體積（一般 500 ml 培養物會得到 500 μl )，在冰上加入相同體積的預冷水重懸細胞。Aliquot 50~300 μl 細胞至預冷的離心管中，細胞密度大約是 2X 1011 個細胞/ml。
( 10 ) 若要凍存電轉化細胞，在第（8 ) 步得到的細胞中加入 40 ml 預冷的 10% 甘油并混勻。離心細胞同第（9 ) 步，估算菌體體積，在冰上加入相同體積的預冷 10% 甘油重懸細胞。Aliquot 50~300 μl 細胞至預冷的離心管中用干冰冷凍，-80°C 儲存。
3.9 制備 XL-1 Blue 和 BL21 pREP4 感受態細胞
按照參考文獻 [ 49 ] 方法準備細胞，稍作改動如下：細胞在第一次離心后僅洗 1 次，4°C 倒置離心瓶于紙上，除去痕量的培養基（見注 29)。
( 1 ) 在 200 ml SOB 或 LB 培養基中加入過夜培養物，18℃（200~250 r/min）培養至 OD600 約 0.6。
( 2 ) 冰浴 10 min 并轉移至 500 ml 離心瓶。
( 3 ) 4°C 2500 g 離心 1 min。
( 4 ) 用 80 ml 預冷轉化緩沖液重懸菌體，并冰浴 10 min，離心同（3 )。
( 5 ) 用 20 ml 預冷轉化緩沖液輕柔的重懸，加入 DMSO 至終濃度為 7%。
( 6 ) 冰浴 10 min。
( 7 ) Aliquot 細胞重懸物，液氮冷凍。 展開 | 