質譜技術在臨床診斷領域的應用趨勢

　　質譜技術是過去幾十年中受到臨床實驗室認可并快速發展的最新技術, 近十年來影響了醫學及臨床實踐的諸多領域。氣相色譜質譜（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）技術最早被應用于各類臨床檢測, 此后各類型質譜技術被不同應用領域所接受, 包括毒理學、微生物學、固相病理學等領域。液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）在臨床檢測領域具有諸多優勢：可對特定物質進行精準定量, 可用于物質鑒定, 具有空間分辨模式檢測能力等。當根據保留時間、相對分子質量及碎片模式分析相似化合物時, LC-MS具有較高的特異性。不同于免疫檢測方法, LC-MS無需抗體, 可分析物質范圍廣, 高度靈活, 應用廣泛。

質譜技術臨床實驗室應用現狀

　　目前, 臨床實驗室使用的質譜技術平臺大致可歸入3類：三重四極桿質譜用于定量檢測, 如新生兒遺傳代謝病（inborn errors of metabolism, IEM）篩查、內分泌/類固醇激素檢測、治療藥物監測、藥物濫用檢測/疼痛管理等； 飛行時間質譜（time-of-flight mass spectrometry, TOF-MS）主要應用于微生物學、蛋白組學及成像領域； 電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）主要應用于生物標志物的鑒定及半定量檢測、藥物濫用檢測、其他“ 組學” 方面。

　　目前, 三重四極桿質譜定量檢測在臨床實驗室最為常用, 且應用范圍不斷擴大, 檢測項目亦不斷增加, 如藥物檢測、內分泌激素檢測及治療藥物監測等。特定分析物包括維生素D[1, 2]、類固醇激素[3, 4, 5]、免疫抑制藥物[6, 7]及IEM相關代謝產物[8, 9]。基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）質譜在細菌鑒定方面有出色的表現[10, 11], 而高分辨率質譜（high-resolution mass spectrometry, HRMS）的精準質量檢測主要被用于蛋白組學及大部分其他“ 組學” 分析[12, 13]。ICP-MS常被用于篩查金屬毒物[14, 15], LC與ICP-MS聯用（LC-ICP-MS）常被用于鑒定各類含金屬化合物, 包括砷、硒、汞、鎘等[16]。

　　定量三重四級桿質譜

　　液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）三重四級桿定量檢測是臨床實驗室最常采用的檢測技術, 采用這一技術開展的檢測項目不斷增加, 圍繞各類生物基質中的待檢物質的研究正在展開, 不斷有新的分析物及方法被報道。目前, 多數檢測項目還是以多重反應監測（multiple reaction monitoring, MRM）為基礎加以開展。

　　LC-MS/MS的發展受敏感性與特異性等多種因素影響, 主要原因是現有免疫檢測技術用于特定待測物質時成本過高或存在干擾物質交叉反應。免疫分析中的干擾物質主要有3類：代謝產物、結構類似物以及與目標分析物活性不同的幾何異構體[17]。在美國, 當缺少經食品與藥品監督管理局（food and drug administration, FDA）認證的免疫分析方法或檢測性能難以滿足預期時, 可選擇質譜法進行檢測。

　　當然, 質譜檢測對服務于內部開發即實驗室自建檢測項目（laboratory developed test, LDT）的技術要求較高, 開發成熟的檢測方法需采用同位素內標, 并備有證明文件。LDT也需滿足由美國FDA、美國臨床實驗室改進修正法規（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988, CLIA'88）、美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency, EMA）及美國各州法規所發布的標準及規定。

　　IEM篩查

　　串聯質譜在技術改進后被用于IEM篩查, 從而最早在臨床化學領域得到認可。雖然主要采用串聯四極桿質譜技術, 但大多數IEM篩查采用的質譜技術依靠流動注射技術進行半定量或定性檢測, 無需進行色譜分離。如結果陽性, 則采用串聯四級桿質譜儀對樣本進行更嚴格的定量分析, 如對酰基肉堿、有機酸、氨基酸及脂肪酸氧化指標進行測定[18]。

　　 臨床毒理學

　　藥物濫用檢測與疼痛管理 藥物濫用檢測與疼痛管理是拓寬質譜技術應用的兩大重要領域。臨床毒理學充分利用了質譜平臺的特異性及多重檢測能力, 當免疫檢測方法提示疑似某類藥物時, 可采用質譜技術對個別藥物是否呈陽性進行驗證。該技術在美國比在中國應用更為廣泛。

　　常見的藥物濫用檢測針對而不限于安非他命、脫氧麻黃堿、苯二氮卓類、丁丙諾啡、巴比妥類、可卡因、美沙酮、大麻及鴉片類藥物, 多可開發為獨立的檢測組合, 進行定性驗證或定量檢測。現有定量檢測多以組合形式進行, 單個組合可檢測多達300種分析物。總體而言, 鑒于不同儀器制造商、儀器模式、液相色譜系統、分析柱類型的選擇及醫院或患者人群的特定需求, 實驗室所采用的檢測方法也不同。

　　新型合成類藥物的不斷出現給藥物濫用檢測領域帶來挑戰。隨著新型藥品的頻繁上市, 需要及時開發出新的檢測方法。美國僅有幾家實驗室具有相關資源及能力可建立針對這些“ 新型化合致幻藥” 的檢測方法, 可作為其他醫院或社區衛生機構的參考實驗室。

　　內分泌/類固醇激素檢測

　　類固醇激素定量檢測在內分泌疾病的診療中發揮著重要作用。人體內有數百種類固醇, 以四稠環體系為基礎, 有相似的化學結構。盡管自動化免疫分析在類固醇檢測中具有巨大優勢, 但該法仍存在缺乏特異性、有基質效應及分析物動態范圍有限等問題。

　　以睪酮為例, 相關檢測對男、女性均具有重要意義, 但極富挑戰。外周血睪酮水平受年齡和性別的影響, 動態范圍跨度很大, 可低于0.7 ng/L, 也可高至120 ng/L。免疫檢測始終在努力實現對低濃度樣本的準確測量, 尤其對女性患者樣本的檢測, 但在內分泌及生殖系統疾病的診斷中仍然存在很多問題[19, 20]。LC-MS/MS檢測睪酮具有更好的準確性及適宜的動態范圍, 定量下限較免疫檢測方法更低[21,22]。睪酮只是臨床診斷所采用的類固醇激素指標之一, 先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia, CAH）常需要通過LC-MS/MS檢測一系列類固醇后進行診斷。

　　LC-MS/MS除具有更好的敏感性外, 與免疫學方法單次檢測僅能測定1種激素相比, 還能通過單次檢測全面體現各種類固醇激素的水平。內分泌激素檢測的另一個例子是維生素D, 在臨床質譜領域也受到廣泛關注。維生素D在美國的檢測需求巨大, 串聯質譜檢測技術在過去幾年中發展迅速, 充分反映了LC-MS/MS在臨床檢測中的特異性優勢。維生素D是一類脂溶性類固醇激素衍生物, 在各類臨床疾病中發揮重要的生物學作用, 缺乏維生素D可導致多種疾病發生。關于維生素D的生物功能及在人體中的含量對人類健康的影響尚有許多爭議, 但臨床診斷時普遍采用外周血25-羥基維生素D對維生素D含量進行評價, 亦常檢測維生素D2和維生素D3代謝產物, 即25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3 。對兒童而言, 分離25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3的3-差向異構體能幫助準確檢測25-羥基維生素D。

　　LDT中有各類檢測維生素D的方法。鑒于分析樣本制備、色譜分析、電離等各檢測步驟的差異, 實驗室間的標準化措施極為有限。這種差異也導致不同實驗室間檢測結果無法互認。美國國家標準和技術研究院（the National Institute of Standards and Technology, NIST）已發布了相應標準, 與監管機構推出的室間質評計劃聯合致力于理順實驗室間檢測結果的一致性。維生素D亦可利用免疫學方法進行檢測, 有多篇文獻對2種方法的性能進行了比較[23, 24, 25, 26, 27]。免疫檢測方法的不足、對LC-MS/MS方法的開發需求以及開發過程中的問題, 在對維生素D的檢測中均得到體現[28]。

　　免疫檢測方法不足以區分25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3, 樣本中的其他同分異構體會造成干擾, 令檢測結果偏高。早期LC-MS/MS方法也無法從目標分析物中分離出維生素D的差位異構體, 同樣會使檢測結果偏高。因此, 對飲食中未含有大量維生素D2或未服用維生素D2藥物的人群, 免疫學檢測不足以對其維生素D水平進行評價。需注意的是, 關于維生素D的代謝機制仍在研究論證中, 隨著新型色譜方法與同位素內標的出現, 未來臨床上將會對更多異構體及/或代謝產物進行準確定量檢測。

　　治療藥物監測

　　免疫抑制藥物雷帕霉素問世后, 其較窄的治療窗令移植患者藥物濃度監測成為必須采取的措施[29]。隨著免疫抑制藥物的開發, 出現了多種藥物的定量檢測方法, 單次分析可同時檢測他克莫司、西羅莫司、依維莫司、環孢霉素A[30]。由于免疫檢測方法的特異性不強, 尤其是待測物質的無活性代謝產物會對免疫檢測方法產生一定的干擾[31, 32], 故多通過LC-MS/MS檢測免疫抑制藥物濃度。隨著其他種類免疫抑制劑的出現, 還需開發相應的新方法檢測其濃度。免疫抑制劑并非唯一通過LC-MS/MS進行檢測的治療藥物, 還有抗抑郁藥物（阿米替林）、抗癲癇藥物（拉莫三嗪及左乙拉西坦）、抗真菌藥（泊沙康唑）及用于監測阿片類藥物依賴的丁丙諾啡, 均可通過LC-MS/MS進行檢測, 從而為患者個性化治療提供參考。

　　方法開發與驗證

　　以上例子均為臨床實驗室廣泛采用的質譜檢測方法, 其中大部分檢測結果直接影響到患者預后。隨著這些方法被開發和利用, 對嚴格遵守操作程序及質量保證計劃的需求愈發凸顯, 室間比對的開展提升了檢測質量。目前關于維生素D定量檢測所開展的工作就是很好的范例。生物相關物質的定量檢測領域不斷被拓展, 新的藥物、生物標志物、代謝產物不斷擴充檢測物列表, 推進了儀器的研發與分析柱及樣品制備方法的改進。新方法及改進后的方法也需要經過全面驗證, 以確保檢測的科學性及可靠性。

　　TOF-MS

　　MALDI TOF-MS是細菌鑒定領域的新趨勢。MALDI為離子源, TOF-MS為質量分析器, MALDI TOF-MS圖譜就像待鑒定化合物或微生物的質量“ 指紋” 。MALDI TOF-MS的出現改變了微生物學百年來的工作模式, 其成功離不開FDA對該領域平臺及應用方法的批準。

　　多家儀器廠商已推出MALDI TOF-MS檢測系統。其周轉快、成本低、鑒定診斷速度快的特點促進了患者預后的改善, 臨床應用日趨增多。MALDI TOF-MS在過去的幾年中日受追捧, 但在操作方面仍如同一個“ 黑匣子” 。與大多數新技術一樣, MALDI TOF-MS也存在著一定的局限性, 如菌種鑒定需基于數據庫匹配, 盡管大部分數據庫可進行擴展, 添加本地菌種譜, 但不在庫中的菌種仍無法被識別。該系統最早被用于鑒定革蘭陰性菌, 對革蘭陽性菌、真菌及其他微生物的鑒定功能正逐漸被開發。質譜圖主要來自核糖體蛋白, 所以即便培養條件不同, 樣本所提供的圖譜仍會保持穩定 [10]。

　　 ICP-MS與LC-ICP-MS

　　臨床實驗室過去主要采用ICP-MS檢測血鉛。該技術適用于血清、血液和尿液中的常量、微量、痕量元素分析。除血鉛外, 這些檢測項目需求小卻會消耗大量的成本及人力, 常作為參考實驗室外送檢測項目。進行ICP-MS檢測的商業化實驗室可檢測多達70種元素, 包括砷、硼、鎘、鈰、鉻、鈷、銅、鐵、鉛、鋰、鎂、錳、汞、鎳、磷、鉑、錸、硒、硅、銀、鈦、鈾、鋅等。

　　有學者嘗試將LC與ICP-MS聯合使用[16]。金屬的化學狀態（形態）對其代謝、生物利用度及毒性影響巨大, 所以單憑其總濃度也許并不能準確反映相應的危害或益處, 因此針對鉑類抗腫瘤藥物及含金屬元素的生物分子的復合物研究也是一個熱點。LC-ICP-MS一般經優化后每次檢測只針對1種元素, 近期方法學的進步允許其同時檢測多種元素。在研究硒對砷中毒的保護作用時, LC-ICP-MS就具有一定的優勢[33]。

質譜技術的新應用

　　隨著對質譜技術需求的增加與研究的進展, 已有許多檢測項目適宜向臨床推廣。質譜技術在臨床診斷領域的各個方面均有巨大發展, 包括針對特定蛋白質、多肽與其他“ 組學” 的定量分析、適用于越來越多臨床情況及分析物的干血斑（dried blood spot, DBS）檢測、MALDI病毒檢測、病理解剖組織成像、試劑盒的開發、儀器的自動化與小型化、即時檢驗等。這些進展為質譜技術及其在臨床診斷與個性化醫療中的應用不斷帶來更多啟示與希望。

　　蛋白組學與其他“ 組學” 分析

　　甲狀腺球蛋白的相對分子質量為660 000, 是LC-MS/MS用于大分子蛋白檢測的范例[34], 其他蛋白及多肽檢測還包括胰島素與生長激素等。不同于小分子蛋白, 大分子蛋白檢測需要采用包括蛋白消化及多肽富集在內的新方法, 以便采用質譜技術進行定量檢測。如目前甲狀腺球蛋白定量檢測方法首先利用胰蛋白酶消化樣本, 繼而以免疫方法捕獲, 再通過LC-MS/MS進行定量。

　　這些步驟在確保敏感性與準確性的同時可提升特異性, 將其省去可大大縮短分析時間、降低分析難度。質譜是蛋白組學研究的主流技術, 同時可用于包括代謝組學、脂質組學等其他“ 組學” 領域。蛋白組學著眼于器官和/或組織特異性蛋白表達, 而代謝組學則著眼于器官或組織功能, 脂質組學是代謝組學中的一個亞類, 著眼于脂質網絡及通路。“ 組學” 譜通過單個研究即可提供豐富的信息, 在精準醫學領域頗受重視。

　　DBS樣本檢測

　　DBS樣本目前主要被用于IEM篩查。無論通過傳統萃取法還是電噴霧電離及MALDI新技術, 利用此類樣本開展各類分析均頗具潛力[35, 36]。目前, 相關研究正致力于提高DBS樣本定量檢測的水準, 以準確反映體液中分析物的水平, 并有望成為替代性采樣手段。但是, 即便分析方法可避免檢測技術現有的問題, 但DBS樣本檢測的固有問題并不會完全消除, 需進一步的研究和更新的技術加以解決。

　　成像技術

　　組織成像有望為固相病理學作出重大貢獻[37]。質譜成像技術能夠于原位對小分子藥物及其代謝物、蛋白質及多肽等多種物質進行檢測, 同時為傳統組織學方法保留空間定位信息, 為疾病研究提供重要信息, 將在不久的未來對解剖病理學的發展產生巨大影響。目前, 供應商正致力于推出具備不同性能水平及復雜程度的檢測系統。雖然圍繞MALDI已進行了許多研發工作, 但新型電噴霧電離正成為另一種選擇[38], 對空間分辨率的要求將影響該領域未來的發展。

　　MALDI

　　MALDI將繼續進軍多個臨床化學領域, 在目前應用最多的細菌鑒定領域也將繼續發展。現有的革蘭陰性菌鑒定文庫將納入更多菌種并提升特異性, 在真菌鑒定方面也已取得了一定的進展, 并有望向其他病原微生物如病毒方面拓展。直接采集體液進行檢測的技術飛躍將縮短這一進程。采用MALDI TOF-MS替代蛋白電泳檢測免疫球蛋白對多發性骨髓瘤進行診斷已獲得階段性成果。除以上應用外, MALDI有望通過DBS檢測協助診斷IEM及進行其他分析[36], 并通過成像技術分析發芯提示化學暴露史[39]。

　　試劑盒

　　試劑盒包含了LC-MS/MS技術檢測特定物質所需的一切材料, 其實用性的增強大大推進了臨床實驗室對LC-MS/MS定量分析的接受度[40, 41]。這些試劑盒包含所需的分析柱、樣品制備材料、校準品、質控品與軟件, 甚至包含流動相和其他所需溶劑, 可減少實驗室在方法開發階段對LC-MS/MS專業人員的需求。實驗室不僅要對這類試劑盒的價值進行評估, 還要對其實際易用性、可靠性及可重復性進行評價。LC-MS/MS的應用是否廣泛很大程度上取決于儀器最初的調試情況, 儀器供應商正不斷努力開發整體解決方案, 以增強臨床實驗室在資源有限的情況下對LC-MS/MS技術的適應性。

　　集成自動化化學分析儀

　　降低臨床實驗室LC-MS/MS應用難度的方案之一是將其整合入大型自動化分析儀, 這需要經過一系列的研發, 但其預期效果值得儀器制造廠商加大投入。利用現成的樣本跟蹤及處理程序可減少或解決許多臨床質譜實驗室所面臨的問題, 如實驗室信息管理系統與質譜儀之間“ 中間件” 的缺乏。此類系統方案將實現LC-MS/MS技術向現有臨床分析模式的集成。

　　小型化及即時檢驗

　　與向自動化學分析儀集成相同, 小型質譜儀的開發給即時檢測帶來了希望。該技術可用于無需精確定量的篩查。小型化大氣壓力噴霧電離技術可用于路邊藥物檢測以確定司機是否服用過四氫大麻酚, 也可用于學校、診所及其他場合的手持質譜篩查儀等[42]。

總 結

　　在過去的10年間, 質譜技術在臨床實驗室的應用越來越廣泛, 其具備傳統方法所沒有的獨特優勢, 包括敏感性和特異性, 特別在缺少經FDA批準的試劑盒可用時, 可滿足實驗室靈活開發LDT以滿足患者需求。質譜技術目前已用于IEM篩查、藥物濫用檢測、疼痛管理、內分泌疾病診斷、治療藥物監測、細菌鑒定及痕量金屬分析等多個領域。這些實驗室開展的檢測項目多基于三重四級桿質譜、TOF-MS及ICP-MS這3類技術平臺。

　　質譜技術依然在蓬勃發展, 且不斷深入到臨床實踐的各個方面, 如蛋白組學和代謝組學分析、臨床實驗室MALDI TOF-MS開發、病理解剖學領域的組織成像技術等。此外, 一些試劑盒也正被研發用于簡化實驗室的LDT。質譜儀的自動化及小型化可大大提高檢測平臺的實用性與靈活性。質譜技術在診斷需求方面已發揮出重要作用, 極具前景。希望通過本文能幫助讀者了解質譜技術當下及未來的應用及發展, 更好地服務患者。