大鼠視神經少突膠質細胞培養實驗——牛血清培養法

Wistar大鼠

亞硒酸鈉腐胺轉鐵蛋白胰島素甲狀腺素黃體酮谷氨酰胺小牛血清兔抗鼠GC抗體

眼科剪滴管離心機培養皿CO2培養箱

一、實驗步驟

1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無菌條件下取出雙側視神經。

2.  接種至24孔培養板內經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。

3.  加入含30g·L^-1 小牛血清的DMEM/F12 培養基，37℃，50mL/L CO₂，100%濕度連續培養3 d 。

4.  3 d 后棄廢液，改為含 5g·L^-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養液繼續培養。

5.  每周換液2次。在獲得足夠的細胞數量后，改用無血清條件培養液繼續培養，每2 d 換液一次。

二、形態學觀察

每天在倒置顯微鏡，觀察培養細胞的生長過程和形態學變化并拍照。

三、免疫細胞化學鑒定

1.  將含細胞蓋玻片取出，0.01 mol·L^-1 PBS沖洗3 次x5 min。

2.  冷丙酮固定10 min。

3.  PBS沖洗(3 次x5 min)。

4.  30g·L^-1 過氧化氫室溫孵育15 min。

5.  PBS沖洗3 次x5 min。

6.  滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。

7.  滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。

8.  PBS沖洗3 次x5 min。

9.  滴加 生物素標記羊抗兔IgG，37℃，20 min。

10.  PBS沖洗3 次x5 min。

11.  滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。

12.  DAB工作 液顯色，自來水終止反應。

13.  脫水，透明，DPX封片保存。

四、結果

1. 形態學觀察結果

組織塊24 h 開始貼壁，48～72 h 可見神經組織邊緣游出少量細胞，主要為圓形或梭形(圖 1)。8～9 d 左右，細胞基本鋪滿培養孔。此時改用無血清條件培養基培養進行純化。培養過程中，部分細胞死亡。12 d 左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約 6～10μm。細胞核較大，胞質少(圖 2)。

2. 免疫組織化學染色結果

培養的視神經少突膠質細胞的免疫組織化學染色 GC 蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結果顯示成熟的少突膠質細胞突起豐富，互相形成蜘蛛網狀(圖 3)。蘇木素復染，異質細胞較少，90%以上為陽性細胞(圖 4)。
 

Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)

圖 1. 培養第 3 天，細胞自視神經遷出 (10x10)

Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)

圖 2. 培養第 15 天，純化的視神經少突膠質細胞(10x40)

Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)

圖 3. 培養第 7 天，少突膠質細胞 GC 陽性表達 (10x20)

Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)

圖 4. 培養第 15 天，純化的少突膠質細胞 GC 陽性表達(蘇木素復染)(10x20)

1. 體外研究發現甲狀腺素、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A 祖細胞朝少突膠質細胞定向分化。

2. 而血清等可以誘導O2A祖細胞分化為Ⅱ型星形膠質細胞。 逐步減少條件培養基中的血清濃度，促進O2A祖細胞向少突膠質細胞分化。                    

免疫染色鑒定結果表明純度較高超過 90%。此方法簡便、可靠、易于推廣，便于對少突膠質細胞相關課題進行研究。

一、討論

抑制神經再生基因Nogo的發現為視神經損傷的修復、視功能保護研究帶來了希望。視神經膠質細胞包括星形膠質細胞和少突膠質細胞2 種類型，分化不同，功能各異。成熟的少突膠質細胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細胞^[1]，培養較為困難。

1980 年McCarthy^[2]等建立了從腦灰質組織分離、純化星形膠質細胞和少突膠質細胞的分離培養模型。目前國內外多采用該法^[3]。利用少突膠質細胞和星形膠質細胞貼壁能力的不同采用振動分離法進行分離、培養。此法主要用來獲取星形膠質細胞，獲得的少突膠質細胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過程中因振蕩離心易造成機械性損傷導致細胞死亡等缺點。

本實驗采用視神經組織塊培養的方法，對新生大鼠的視神經膠質細胞進行條件化原代培養，利用少突膠質細胞和星形膠質細胞生長條件的不同，采用條件培養基純化2 種細胞。

少突膠質細胞和Ⅱ型星形膠質細胞是從一種普通雙潛能的少突膠質細胞－2  型星形膠質細胞祖細胞發育而來^[1]。

大鼠出生后約1 周，少突膠質細胞逐漸成熟。

因此，從新生大鼠取材可獲得O2A祖細胞。

體外研究發現甲狀腺素、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A 祖細胞朝少突膠質細胞定向分化。

而血清等可以誘導O2A祖細胞分化為Ⅱ型星形膠質細胞^[1、4]。

我們利用這一特點，逐步減少條件培養基中的血清濃度，促進O2A祖細胞向少突膠質細胞分化。

最終采用無血清條件培養基，抑制星形膠質細胞及其它異質細胞增殖，而少突膠質細胞在此條件下則基本不受影響。

GC是表達于少突膠質細胞膜以及髓鞘的一種主要類脂，它是識別少突膠質細胞普遍應用的特異性化學標志物^[1、3]。

免疫染色鑒定結果表明純度較高超過 90%。此方法簡便、可靠、易于推廣，便于對少突膠質細胞相關課題進行研究。

二、文獻
 

1. 何平，沈馨亞. 少突膠質細胞增殖和分化的研究進展[J],神經解剖學雜志 ,2000,16(2)：183-188.

2. McCarthy K D, DeVellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglia cell cultures from rat cerebral tissue [J], J Cell Biol 1980,85: 890-902.

3. 伍亞民,馬海涵,廖維宏. 大鼠星形膠質細胞和少突膠質細胞的純化培養與鑒定[J],創傷外科學 2000,4：207-209.

4. Raff MC, Miller RH, Noble M. A glial progenitor  cell  that  develops  in  vitro  into  an  astrocyte  or  an oligodendrocyte depending on culture medium [J],Nature 1983,303(5916): 390-6.