用端粒酶誘導人類間充質干細胞永生化實驗

1. 從動物或人組織中提取的細胞，在體外培養中，細胞會有不同程度的分裂增殖，稱為增殖性衰老 。但是有些細胞在自發或其他條件誘導下可突破增殖性衰老，擁有無限增殖的能力，成為永生化細胞，骨髓來源的間充質干細胞屬于多能干細胞，可作為組織工程種子細胞的來源。

2. 端粒酶對染色體的穩定性及決定細胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉移酶是由兩個主要的亞單位構成：RNA成分（hTR）和蛋白質分解亞單位（hTERT），RNA（hTR）亞單位普遍表達于正常和腫瘤組織中，而蛋白質分解亞單位（hTERT）僅在腫瘤細胞、生殖譜系細胞及激活的淋巴細胞中表達。

3.  細胞衰老機制現在管遍接受的是細胞衰老兩階段模型-M1/M2模型，細胞在生長過程中，經過多次分裂后，在腫瘤抑制因于p53和pRb等作用下，細胞對生長因子的反應消失，出先有絲分裂反應的消失，DNA合成抑制蛋白的產生。DNA合成停止，細胞不可逆的停滯于G1期，發生衰老（sesence. M期），細胞發生凋亡或死亡，永生化指的是在體外培養的細胞自發的或受外界影響從增殖衰老中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。

人間充質干細胞

葡萄糖L-谷酰胺胎牛血清青霉素鏈霉素聚凝胺

培養瓶多孔板

材料 
無菌

生長培養基：含高濃度葡萄糖（4.5 g/L）的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培養液（DMEM），添加 L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 ug/mL 鏈霉素

聚凝胺： 8 mg/mL
普通容器 ：培養瓶 25 cm²，75 cm²

反轉錄酶病毒載體的產生用材料 
細胞系:
PG13
GP+E-86
反轉錄病毒載體 GCsam hTERT
轉染用 htrt DNA
Tx 緩沖液 ：總量 20 mL，含有以下物質：

HEPES 0.5mol/L，pH 7.1   200uL
NaCl，5rnol/L   100uL
Na2 HPO4/NaH2PO4，1mol/L   3uL
UPW   1.7 mL

緩沖液 A：總量 20.04 mL，含有以下物質：

NaCl（5mol/L）   600uL
EDTA（0.5mol/L）40uL
Tris-HCl，pH7.5（0.5mol/L）400uL
UPW   19 mL

hMSC（人間充質干細胞）細胞的轉導用材料 
hMSC（人間充質干細胞）細胞
培養瓶 75 cm²
多孔板 6 孔
轉導后用材料 
用于冷凍保存的實驗材料（見方案 20.1）
用于 DNA 指紋分析 (見方案 16.8) 或 DNA 圖譜分析（見方案 16.9）或其他驗證分析方法的實驗材料（如方案 16.10）

PCR 試劑 
DNA 100 ug/mL
10x PCR 緩沖液 L（含 Mg²⁺）
正向引物（2umol/L）
反義引物（2umol/L）
dNTP 混合物（10 mmol/L）
DNA 聚合酶
UPW

操作步驟 
反轉錄酶病毒載體的產生 
具有 hTERT 基因的反轉錄酶病毒載體通過兩個步驟包裝進入長臂猿白血病病毒（GALV）包裝的細胞系 PG13。首先，使用 20 ug/mL htrtDNA（Geron）轉染包裝細胞系 GP+E-86，然后用上清液感染 PG13 細胞。

1. 6.7x105 GP+E-86 細胞系接種在一個小培養瓶（25 cm²）中。

2.GP+E-86 細胞系的轉染
（a）將 280uL Tx 緩沖液加人每個管中（常用容器）。
（b）制備 DNA 管：

組成名稱    DNA 濃度   15 ug DNA      緩沖液 A       CaCl₂2.5mol/L     總量
                       Z*ug/uL       X*uL            280-30-X                  30                280

* X x Z = 15 ug

（c）將 Tx 緩沖液逐滴加人含有 DNA 溶液的管內，輕輕地混合。
（d）在室溫下孵育 30℃，使其產生沉淀。
（e）在每個含有 GP-E-86 細胞的 25 cm2 培養瓶中，加入 5 mL 新鮮培養液。
（f）輕輕加入混合液（Tx+DNA）至 GP+E-86 細胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。
（g）在 25 cm² 培養瓶內，用 D-PBSA 小心地洗三次。
（h）加新鮮培養液至細胞中，在 37℃ 孵育過夜。

3. 更換細胞培養液，加 2 mL 新鮮培養液 (取代以前 5 mL 培養液)，以產生病毒。

4. 在進行第三步的同一天，將 1x10⁴個 PG13 細胞接種于 6 孔板的每個孔中。

5. 次日，從感染的 GP-E-86 細胞收獲其上清液，加入最終濃度為 8 ug/mL 的多聚胺 (如 1 ug/mL 上清液)。

6. 用孔徑 0.45 um 濾膜過濾上清液，將 2 mL 過濾液加至含 GP-E-86 細胞的每個孔中。

7. 在 32℃ 1000 g 離心培養板。

8. 在 37℃ 孵育過夜。

9. 次日，更換細胞的培養液。

hMSC 細胞的轉導 
1. 將 2x10⁶ PG13 細胞種人 75 cm2 培養瓶中。

2. 次日，將 6 mL 新鮮培養液加至 PG13 細胞中。

3. 第三日，將 hMSC 細胞（約 2.5x10⁴~7.5x10⁴ 個）加至 6 孔板中，用于轉導。

4. 從包裝的細胞收獲上清液，加入最終濃度為 8 ug/mL 的多聚胺，用孔徑 0.45 um 的濾膜過濾上清液。

5. 將 2 mL 過濾后的反轉錄病毒上清液加入 6 孔板的每個孔中。

6. 在 32℃ 1000 g 離心培養板，37℃ 孵育過夜。

7. 吸去逆轉錄病毒上清液，加入新鮮培養基。

轉導后培養物的處理 
1. 經過 10~12 次傳代接種，未接受 hTERT 基因的細胞將死亡，剩余的細胞 則肯定已插入 hTERT 基因，具有 hTERT 基因的細胞將在傳代過程中被選擇出來。

2. 建議將細胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個轉導細胞的貯備庫，這些轉導細胞處于不同的群體倍增（PI）水平（可與 PD 生長曲線相匹配）。這樣做也可節省時間，因為如果發生污染就要丟棄培養的細胞，重新開始。

3. 在梅次傳代培養時，用下列公式獲得 PD，以建立 PD 生長曲線。

公式中的 PD 代表種群倍增的次數，In 是自然對數 Nstart 是細胞初始接種量，Nfinish 是細胞在傳代培養過程中所獲得的全部細胞數。
例 1，如果最初種入 2x10⁵個細胞，培養后增加至 3.2x10⁶個細胞，則：

如果按 1:4 的細胞量進行傳代培養，則每次傳代培養后的 Nfinish 將乘以 4。所以在上述例子中，假設有 10 次傳代培養，Nfinish 就是（3.2x10⁶）x4 的 10 倍，也就是 3.4x10¹²。

例 2，如果最初種入 2x10⁵ 個細胞，培養后可增加至 3.2x10⁶個細胞。以 1:4 的細胞址傳代培養 10 次，則：

4. 在建立永生細胞系之后，必須檢查其真實性，以確保其來源于最初的材料， 而不是由于交叉污染從實驗室其他永生細胞系衍生而來（見 19.5 節）。這是能做到的，例如針對轉移基因（hTERT）（見下）的 PCR 檢測、DNA 指紋檢 測（見方案 16. 8）或 DNA 圖譜檢測（見方案 16.9）。

hTERT 的 PCR
1. 溶解 PCR 試劑并保存在冰塊中 

2. 對下列試劑進行仔細的混合，記住，一定要包括陽性對照（其他 hTERT 陽 性標本）和陰性對照（無 DNA 模板）
DNA1uL（100ng）   100 ug/mL
10xPCR 緩沖液（含Mg²⁺）   2uL

正義引物   2uL
反義引物   2uL
dNTP 混合物（10 mmol/L）   0.4uL
DNA 多聚酶   0.1uL
UPW   12.5uL
最終體積為 20 mL（包括 DNA）

3. 將管子置于 PCR 儀器中，按以下步驟進行操作：90℃，3 min，首先進行變性作用；94℃，30s，再次進行變性作用；59℃，39s，進行復性；74 ℃，1 min，進行延伸；如此循環 30 個周期，然后是 74℃，1 min。

4. 將 PCR 產物在 1.5%~2% 瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1. 將細胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個轉導細胞的貯備庫，這些轉導細胞處于不同的群體倍增（PI）水平（可與 PD 生長曲線相匹配）。這樣做也可節省時間，因為如果發生污染就要丟棄培養的細胞，重新開始。    
   

   
   

2. 在建立永生細胞系之后，必須檢查其真實性，以確保其來源于最初的材料， 而不是由于交叉污染從實驗室其他永生細胞系衍生而來。

參考轉導人端粒酶逆轉錄酶基因致人骨髓間充質干細胞永生化的研究