堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）免疫組化染色技術

APAAP

TBS固定液

載玻片制片機濕盒顯微鏡

1.  分離外周血單個核細胞（PBMC），洗滌后用含10 ％FCS PMI1640調整細胞濃度約5×10⁶ /ml

2.  自制制片機上制片，充分干燥

　　　　　　　　
3.  用含丙酮-福爾馬林固定液中固定30 秒鐘

4.  自來水、蒸餾水依次沖洗

5.  用TBS稀釋特異性McAb或陰性對照抗體（1∶50～500），每片加30～50 μl

6.  室溫濕盒孵育30 min，或4 ℃冰箱濕盒中過夜

7.  充分用TBS沖洗后，加1∶50羊（兔）抗鼠IgG（GAM或RAM IgG）30～50 μl

8.  室溫濕盒孵育30 min

9.  TBS沖洗后加堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（1∶2000）復合物（APAAP）

10.  TBS沖洗后可重復疊加GAM或RAM IgG和APAAP2 次，每次孵育10 min

11.  沖洗后底物液顯色10～15 min

12.  自來水沖洗，蘇木精襯染，光鏡下觀察

1.  細胞表面抗原的強度以新鮮分離細胞制片、固定為好。若需保存最好干燥密封貯存于-20 ℃低溫冰箱中，使用前必須充分干燥后固定。

　　
2.  APAAP中堿性磷酸酶和抗堿性磷酸酶的比例非常重要，抗體濃度過高，易封閉橋抗影響染色結果。

　　
3.  一抗、橋抗和APAAP復合物使用的濃度視細胞表面抗原密度而定，每步洗滌要充分。