PCR測定支原體

Taq DNA多聚酶引物陽性對照DNA脫氧核苷三磷酸混合物三磷酸瓊脂糖1.3%TAE膠

磷酸緩沖鹽溶液液Tris醋酸EDTA6×加樣緩沖液引物儲備液

DNA抽提和純化系統基質的DNA抽提試劑盒熱循環儀

一、DNA 標本的收集和制備

1. 需要檢測支原體污染的細胞系，在收集樣品前數天或至少在解凍后兩周內，不能加任何抗生素。應保證支原體在培養上清中的效價在 PCR 測定范圍之內。

2. 收集 1 ml 貼壁細胞或懸浮細胞的培養上清液。這樣收集的標本包含活的或死的細胞，其優點是一些支原體會明顯地黏附在真核細胞上，甚至侵入細胞中。上清液可貯存在4°C 數天或 -20°C 數周。在樣品溶化后，應立即操作。

3. 上清液在 13000 g 離心 5 min，將沉淀用 1 ml D-PBSA （D-PBSA （磷酸緩沖鹽溶液液）：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na₂HPO₄，1.5 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.2；121℃，20 min 高壓滅菌）重懸浮，渦旋混勻。

4. 再次離心懸浮液，用 D-PBSA 沖洗一次以上，如步驟3。

5. 離心后的沉淀用 100 μl D-PBSA 重新懸浮，渦旋混勻，然后加熱至90°C，15 min。

6. 在分解細胞后，采用標準酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法或其他 DNA 抽提方法立即抽提 DNA 。

二、PCR 反應

建立規則以避免 DNA 加入過多，嚴格按照以下步驟進行：

①DNA 抽提的地方和 PCR 進行的地方及 PCR 之后走膠的地方應分開；

②所有試劑應以最小量分裝以保證能恒定提供無污染的試劑；

③避免重復擴增（reamplification）；

④貯存只用于 PCR 操作的吸量管、吸頭、試管，經常用紫外線照射；

⑤連續進行 PCR 操作，應嚴格按以下步驟進行；

⑥在樣品制備及 PCR 進行的全過程，應戴手套操作；

⑦應包括相應的對照反應，內對照、陽性對照、陰性對照及水溶液對照。

1. 用以下溶液對每個樣品進行二次測定

僅用于樣品：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 緩沖液，9.5 μl 蒸餾水。

用于樣品和內對照 DNA：1 μl NTPs，1 μl Myco-5'，1 μl Myco-3'，1.5 μl 10× PCR 緩沖液，8.5 μl 蒸餾水，1 μl 內對照 DNA，事先混合后貯存多份樣品，三個樣品用于無內對照反應（包括陽性、陰性及水溶液反應），兩個樣品用于有內對照反應，包括陽性、陰性對照，總體積要富余一些以彌補吸取過程的損失。



2. 將 14 μl 已混合好各種貯備液加入到 0.2 ml PCR 反應管，加入 1 μl 蒸餾水用作水對照反應。

3. 制備多聚酶混合液（每個反應 10 μl，再加額外 10 μl，以保證吸取足夠量）。

每個反應中含有 1 份 PCR 緩沖液和 1 單位 Taq 多聚酶。

4. 移去所有用于制備事先混合貯備液的試劑。

5. 取出欲測試 DNA 樣品和陽性對照 DNA ，不要同時處理試劑和樣品。

6. 加 1 μl DNA 制備液至一個不包含內對照 DNA 反應管內，另加 1 μl DNA 制備液至一個包含內對照 DNA 反應管內。

7. 進行熱啟動 PCR，將反應混合物（未加多聚酶）轉移至加熱反應器中，依照下面步驟進行一個加熱周期；

第一步：95°C，7 min；

第二步：72°C，3 min；

第三步：65°C，2 min；

第四步：72°C，5 min 。

在第二步時，打開加熱器蓋子，加入 10 μl 多聚酶混合液至每個管內，如有許多樣品則操作時間可能延長。打開或關閉反應管應分開進行，以避免樣品的揮發。在繼續進行下個周期步驟前，在加入 Taq 多聚酶至最后一個反應管和關閉加熱器蓋前至少應有 30 s 以平衡溫度以及移去蓋上冷凝物。

8. 在開始笫一個周期后，按照以下參數進行 32 個加熱周期：

笫一步：95°C，4 s；

笫二步：65°C，8S；

笫三步：72°C，16s；

每個周期再另外延 1 s 。

9. 72°C，10 min 完成最后的擴增步驟，結束反應，然后將樣品冷卻至室溫。

10. 制備一個含有 0.3 μl 溴化乙啶 /ml 的 1.3% 瓊脂糖-TAE 膠，膠上用 1×TAE （50× TAE（Tris 醋酸 EDTA）： 2 mol/L Tris 基液，5.71% 冰醋酸（V / V），100 mmol/L EDTA，調節 pH 至 8. 5）覆蓋，每孔加入 12 μl 擴增產物（10 μl 反應混合物，2 μl 6× 加樣緩沖液（6× 加樣緩沖液：0.09% （W / V），溴酚藍，0.09% （W / V）二甲苯藍FF，60 % 甘油（V / V )，60 mmol/L EDTA）），10 V/cm 開始電泳。

11. 紫外線掃描顯示特異產物，記錄擴增結果。