細胞膜的制備方法實驗——分離頂層膜、基底膜或中間膜

包被緩沖液PAA裂解緩沖液Nyoodenz

陽離子硅膠微型離心機臨床臺式離心機超離心機吊桶式轉頭離心管

1. 制備下列溶液：

(1) 包被緩沖液（CB）

20 mmol/L MES

135 mmol/L NaCI

0.5 mmol/L CaCl₂

1 mmol/L MgCl₂

pH 5.5

(2) 1% 溶于 CB 緩沖液的陽離子硅膠

(3) 溶于 CB 的 1 mg/ml PAA

用 NaOH 和 pH 試紙調節 pH 值到 5.5。

(4) 含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液

(5) 70% Nyoodenz，配法同總細胞膜的分離

2. 準備下列儀器：

微型離心機

臨床臺式離心機

超離心機

吊桶式轉頭和合適的離心管

5 ml 注射器

18 G 針頭，去掉針尖，磨鈍并壓扁針頭以使之能噴出扇形細滴液體

橡皮淀帚或細胞刮

中等大小探頭的超聲儀

有碎冰的淺盤

小鋁碟或銅碟：要能放在淺冰盤上以在超聲處理過程中支撐培養皿于冰上，能允許較好的熱交換以減小冰融化后培養皿傾倒的可能性。

3. 取生長于細胞培養皿上的匯合或部分匯合的細胞。35 mm 培養皿最好，與細胞匯合后 8 個平皿可以提供 10⁷ 個細胞。

4. 用無血清培養基或含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 溶液洗滌細胞 2 次。

5. 培養皿放到冰盤上的鋁碟或銅碟上。用 1 ml 4℃ CB 洗細胞一次。細胞和溶液在以下所有步驟中都要保持 4℃。

6. 倒掉 CB，加 1 ml 1% CB 溶液中的硅膠以包被頂層膜，放置 1 分鐘。

7. 倒掉硅膠溶液，加 1 ml CB。

8. 倒掉 CB 溶液，加 1 ml 1 mg/ml PAA/CB，放置 1 分鐘。

9. 倒掉 PAA/CB 溶液，加 1 ml CB。

10. 倒掉 CB 溶液，短吋間加 1 ml 含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液并快速倒掉緩沖液。再加 1 ml 含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液并置冰上 15~30 分鐘以溶脹細胞。

11. 用壓扁了的接在注射器上的針頭將 1 ml 裂解緩沖液噴灑在單層細胞上，以 45° 角噴射以加以強大的剪切力。

12. 整個培養皿底部全部處理完成后，將裂解物倒入 50 ml 的錐形離心管中。基底膜在裂解過程中通常會貼附在培養皿底。在處理其他培養皿的時候，用 1 ml 裂解液覆蓋基底膜并置于冰上。

13. 將所有細胞皿中殘留的裂解物混合加到第 12 步用過的離心管中。將培養皿立起來以確保取到盡可能多的裂解物。照第 15 步的方法將硅膠包被的頂層膜與中間膜和細胞核分離開。

14. 用下面兩種方法中的任何一種收集基底膜：

(1) 直接溶于含 2% SDS 的裂解緩沖液中

① 往每個平皿中加 0.1 ml 2% SDS，用橡皮淀帚將細胞膜刮起來。

② 收集 SDS 溶液并煮沸，直到細胞膜完全溶解。

(2) 對于需要非變性蛋白的生化分析

① 在不含去污劑的裂解緩沖液中用橡皮淀帚將基底膜刮起來，每個平皿用大約 0.1 ml 裂解緩沖液。

② 收集所有裂解物到一個離心管中，用微型離心機 14000 g 離心 15 分鐘沉淀基底膜。

③ 取出并去掉上清，基底膜沉淀可以溶解于 2% SDS 中并煮沸。

15. 用上述分離總細胞膜方案的 12~17 步中描述的一步或兩步法將硅膠包被的頂層膜同中間膜分離。