結締組織類細胞培養實驗——巨噬細胞培養實驗

Eagle肝素血清

解剖臺蠟板鑷子解剖剪注射器針頭離心管吸管培養瓶細胞計數器

培養巨噬細胞可用各種方法和各種來源獲取細胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養方法大同小異。

1.  實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯1 ml（勿注入腸內）；

2.  引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入70 %酒精中3~5 秒；

3.  置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁；

4.  再用70 %酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10 ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動；

5.  用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內；

6.  小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250 g（4 ℃）離心10 分鐘后，去上清，加10 ml Eagle培養基；

7.  計數細胞，每只小鼠可產生20~30×10⁶ 細胞，其中90 %為巨噬細胞；

8.  為獲取3×10⁵ 個貼附細胞/平方厘米，需接種2.5×10⁶ /ml；

9.  為純化培養細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養液，用Eagle液沖洗1~2 次后，再加新Eagle培養液置37 ℃CO₂溫箱中培養。

一、培養技術要點

1.  來源和取材

巨噬細胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。在不加任何刺激物自然情況下，一個小鼠腹腔中，就含有2~3×10⁶ 個細胞，而且大多無炎癥反應，沖先出來即可用于培養。如欲獲取多量巨噬細胞，可于取材3~5 天前，向動物腹腔中注射刺激物，便能獲得大量細胞。刺激物種類很多，如牛血清、礦物油、硫羥乙酸鹽肉湯等，均能刺激產生大量巨噬細胞；缺點是很多刺激物能激活吞唾細胞并被其吞噬，進行培養以后，刺激物常不能很快被消化掉，殘留在細胞內，能干擾細胞代謝。用40 μg的PHA注入腹腔中，能產生6~8×10⁶ 個細胞，而且無刺激性，效果較好。從500 ml血中能獲取10⁸ 個單核細胞，但易雜以血小板及其它白細胞，尚需做進一步的分離和純化。

2.  純化和分離

從各種來源和用各種方法所獲的巨噬細胞群中，多混有其它細胞成分，如淋巴細胞、中性細胞、血小板和成纖維細胞等，應把它們分離出去。附著分離法比較實用，原理是借用大多數單核巨噬細胞有極易附著于玻璃表面的特性，在先把細胞群置于玻璃培養容器中數小時后，巨噬細胞能最先附著于玻璃表面，此時再用培養液或PBS 沖洗掉尚未附著的中性粒細胞和激活的T 淋巴細胞等，剩余巨噬細胞純度可達95 %。如中性粒細胞也附著，可繼續延長時間至24 小時，此時大多數巨噬細胞都已附著于瓶壁，而中性粒細胞可變性死亡。繼之再從瓶壁上把巨噬細胞分離下來進行培養，便獲得純凈巨噬細胞。

巨噬細胞對胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之離壁，必要時可用膠刮刮除，但可能損傷細胞。用不加防腐劑的純利多卡因處理（干液為PBS配的360 mM液，用1 N NaOH調節pH值到6.6，同時稀釋成12 mM濃度），加入培養基中，37 ℃作用5 分鐘，可使巨噬細胞變圓，此時稍加吹打，即可使細胞分離。注意要控制好作用的時間，以免細胞丟失。

3.  培養條件

據實驗目的不同，可選用各種培養基：如199（加新鮮谷氨酰胺加青鏈霉素）；NCTC-135；RPMI 1640；Ham12等均適于巨噬細胞培養。大多數巨噬細胞培養可加10 %~40 %的血清，小鼠巨噬細胞加10 %小牛血清，用無血清培養基亦可。新生小牛血清中含有抗體，能刺激巨噬細胞成熟。也可用乳清蛋白培養。巨噬細胞適于CO₂溫箱培養，pH7.2，細胞接種密度以2~4×10⁵ /cm²為宜。

4.  生物性狀和鑒別

培養中的巨噬細胞在很多方面與淋巴細胞或其它白細胞相似，應嚴加區別。正常巨噬細胞能附著瓶壁，胞質延展，細胞大小介于10~50 微米之間，胞核呈特有的腎形，胞質有皺褶，細胞群多時能連接成單層；有時細胞呈多角形并連接成網狀。巨噬細胞對胰蛋白酶有抵抗性，借此可下其它細胞相區別，也是淘汰其它細胞的方法。單核巨噬細胞胞質中含有豐富的非特異性脂酶，并具有C3b和FC表面受體。巨噬細胞對培養環境敏感，很易發生與在體內時很大不同的改變；有強烈的吞噬活動。如向培養環境中加入淀粉粒、乳膠粒、紅細胞及調理素（或新鮮血清、特異抗體）等，可見巨噬細胞能吞噬五個以上的顆粒。

細胞狀態不良時，胞質常不延展，胞體變圓，不透明，或脫離瓶壁飄浮在培養液中和失去吞噬能力。