補體介導的細胞毒實驗——補體介導法

帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞）與相應抗體結合后，在補體的參與下，引起靶細胞膜損傷，導致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞，而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。

本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協同作用，可殺傷95%以上的胸腺細胞。

C57BL／6J小鼠

Hank’s液單克隆抗體補體伊紅-Y染液

眼科剪眼科鑷平皿不銹鋼網試管吸量管尖吸管載玻片蓋玻片顯微鏡

一、實驗方法

1.  小鼠胸腺細胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不銹鋼網上研磨后，過篩，放入試管，離心1 000 rpm，5分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細胞重懸于Hank’s液中，配成1×10⁷/ml細胞懸液。
 

2.  取試管3支，標明順序，依據下表依次加入1×10⁷/ml胸腺細胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分鐘。

3.  取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻，室溫放置2分鐘。

4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3管中細胞死活情況。

二、實驗結果

死細胞呈紅色，無光澤且腫脹變大；活細胞不著色、有光澤且形態正常。

高倍鏡下計數200個細胞并計算其中死細胞的百分數。計算公式如下：死細胞百分數= EQ EQ \F(實驗管死細胞數%-對照管死細胞數%，100%-對照管死細胞數%)

1.  胸腺細胞制備速度要快，且需在冰浴中進行操作，以保持細胞活力；

2.  抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預實驗中確定；

3.  細胞對照管死細胞數若超過5%，實驗需重新做；

4.  細胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導致假陽性反應。

一、實驗材料

1.  解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80～100目不銹鋼網；

2.  試管、1 ml吸量管、尖吸管；

3.  載玻片、蓋玻片；

4.  C57BL/6J小鼠；

5.  含5%NBS的冷Hank’s液；

6.  抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（最適稀釋度，本室制備）；

7.  補體(豚鼠新鮮血清并經小鼠胸腺細胞吸收，預先測定效價并稀釋為最佳稀釋度)；

8.  1%伊紅-Y染液。

二、多重PCR的特點

1.高效性

在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2.系統性

多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢。

3.經濟簡便性

多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。