蛋白質磷酸化的測定實驗—代謝標記

細胞

培養瓶

1. 用 60 mm 或 100 mm 培養瓶，在完全培養基中培養細胞至所希望的密度。

2. 用預熱的低磷酸培養基（無放射性磷酸鹽）沖洗兩次，然后加入含 0.5~1 mCi³²P/ml 的低磷酸培養基（50~100 μmol/L 無機磷酸）。

3. 培養結束后，回收 ³²P 標記培養基，用 10 ml Aquasol (NewEnglandNuclear) 或 Ecolume(ICNBiomedicak) 稀釋，取一等份用液閃計數器測定 ³²P 活性。測定培養基中磷酸濃度 （Sanui 1974）（可以用無 ³²P 的低磷酸培養基)。從這兩個數據計算標記培養基 中 ³²P 比活 。

4. 無二價離子的 PBS 清洗 ³²P 標記的細胞兩次。每個 100 mm 培養皿加 1 ml 預熱的裂解緩沖液在沸水浴中裂解細胞。用一次性細胞刮刷將細胞裂解物刮到一邊，然后吸到 1.5 ml 離心管，熱水浴 10 分鐘。

5. 冷卻至室溫。由于 DNA 的舒展，裂解物變得很黏稠。

6. 留上清，加 NP40 至 2%，加 MgCl₂ 至 5 mmol/L ( 都用母液）。加無蛋白酶的 DNA 酶Ⅰ與 RNA 酶各 0.1 mg，室溫放置 20 分鐘。