用蛋白質底物進行蛋白質激酶分析—凝膠蛋白質激酶分析

Tris-HClDTT鹽酸胍尿素激酶分析緩沖液

SDS-PAGE

1. 準備下列材料：

SDS-PAGE 要用到的所有試劑

50 mmol/L Tris-HCl，室溫（pH 8.0)，1 mmol/L DTT

6 mol/L 鹽酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，室溫（pH 8.0），1 mmol/L DTT

8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，室溫（pH 8.0)，1 mmol/L DTT

50 mmol/L Tris-HCl，4℃ 時（pH 8.0)，1 mmol/L DTT，0.05% Tween-20

5% TCA 溶液（w/v）

適宜的激酶分析緩沖液

ATP 儲存液

[γ-³²P] ATP（3000 Ci/mmol）

2. 配制合適的丙烯酰胺濃度的聚丙烯酰胺凝膠溶液。往凝膠混合物中加入 10X 激酶底物儲存液至終濃度 1 mg/ml。灌膠，按常規方法聚合。

3. 制備 SDS-PAGE 用的蛋白質樣品，加樣，開始電泳。

4. 電泳結束后，放入 200 ml 含 20% 丙醇的 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L DTT 中。沖洗 20 分鐘，然后用新鮮緩沖液再同樣沖洗兩次。

5. 用 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)，1 mmol/L DTT 沖洗凝膠 3 次，每次 20 分鐘。

6. 用含 1 mmol/L DTT 的 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶解的 6 mol/L 鹽酸胍、或 8 mol/L 尿素清洗凝膠。洗兩次，每次 250 ml，3 分鐘。

7. 于 4℃，18 個小時內，用 250 ml 含 1 mmol/L DTT 和 0.05% Tween-20 的 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0) 清洗凝膠 8 到 10 次，以使蛋白質復性。

8. 用 250 ml 無 ATP 但有 Mg²⁺ 的適宜的激酶分析緩沖液孵育凝膠。于 30℃ 孵育 20 分鐘。

9. 吸干緩沖液，將凝膠放在一個小盤子或熱封式塑料袋里，準備進行放射性實驗。加入盡量少的激酶分析緩沖液，使得剛好蓋住凝膠。加入 ATP 儲存液至終濃度 50 μmol/L 與 20 μCi/ml [γ-³²P] ATP 。

10. 第一次嘗試于 30℃ 孵育 1 小時。

11. 用 250 ml 5% TCA 浸泡凝膠 2 次，每次 15 分鐘，然后用 500 ml 含有 1% 焦磷酸鈉的 5% TCA 浸泡凝膠。沖洗凝膠，直至溶液不再有放射性。

12. 將凝膠放在濾紙上晾干，放射自顯影。