一、準備 DEAE 柱和材料
1. 準備貯存液和材料
200 mmol/L 焦磷酸鈉（NaPPi )，pH 7.0
用 HCl 和 H3PO4 調 NaPPi 溶液的 pH 值
2x 柱平衡緩沖液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
2 mmoI/L DTT
6 mmol/L NaN3
2. 把 DE-52 懸浮在 15 倍體積的 0.5 mol/L HCl 中，攪拌 30 分鐘。
3. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 超過 4.0。
4. 在 15 倍體積的 0.5 mol/L NaOH 中懸浮 DEAE，攪拌 30 分鐘。
5. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 為 8.0。
6. 重復酸和 dH2O 這兩步（步驟 2 和 3 )。
7. 用濃縮的（2 x ) 柱緩沖液滴定到合適的 pH 值。
8. 用 1x 柱緩沖液平衡 DEAE。
1x 柱緩沖液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
10 倍體積的緩沖液換 3 次可能比較合適，但是平衡與否應該通過比較起始平衡緩沖液和從沉降了的柱床上取的上清的電導率和 OD280 值來檢驗。
9. 用平衡了的 DEAE 準備一個 2.5 cm x 60 cm 的柱子（用合適的管路）。
10. 用合適的管路做一個 1 L 的梯度生成器（每個杯子 1 L）。
(1) 加大約 1.05 L 1X 柱緩沖液到梯度生成器的杯子中。
(2) 通過瞬時打開閥門然后關上來趕走閥門和管路中的空氣。
(3) 在另一個杯子中加 1 L 高鹽緩沖液。
高鹽緩沖液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
其中含 0.5 mol/L NaCl
(4) 去掉多余的緩沖液使梯度生成器兩邊的溶液高度相等。
(5) 在產生梯度前打開杯子間的閥門。
(6) 從梯度生成器的低鹽和高鹽杯子中保留小部分樣品。使用這部分樣品來校正電導率測量值，這樣就可以通過組分的號碼或體積來知道梯度的鹽濃度。
二、用柱層析來純化肌球蛋白
1. 取 60 mg 用前面的方法獲得的肌肉肌球蛋白在肌球蛋白-DEAE 透析緩沖液中透析。
肌球蛋白-DEAE 透析緩沖液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
2. 在以上述方法準備的 2.5 cm x 50 cm DEAE 柱上加 60 mg 肌球蛋白（5 mg/ml）。
3. 流速調整為 0.5 ml/分鐘并立即開始收集組分（穿過峰 )。
4. 用 1x 柱平衡緩沖液洗柱子直到洗脫液的 OD 值和平衡緩沖液的相同（3~5 個柱體積）。
5. 用平衡緩沖液以 0~0.5 moI/L NaCI 線性梯度洗脫肌球蛋白（2 L 總體積，如上面步驟 10 所述配制），收集 10~20 ml 組分。
6. 用 2~3 倍體積的高鹽（柱平衡緩沖液中含 1 mol/L KCl）洗柱子來洗脫所有殘余的結合蛋白。
7. 檢測組分的電導率，蛋白濃度，并通過 SDS-PAGE 檢測多肽組成。 展開 | 