多克隆抗體制備實驗_弗氏佐劑免疫法

當將抗原注射入實驗動物體內時，一系列抗體生成細胞會不同程度的與抗原結合，受抗原刺激后在血液中產生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產生的抗體稱為多克隆抗體。多克隆抗體中不同的抗體分子可以以不同的親和能力與抗原分子表面不同的部分-抗原決定簇相結合。
 

將抗原導入敏感動物體內后，可刺激網狀內皮細胞系統，尤其是淋巴結和脾臟中的淋巴細胞大量增殖。如圖所示，實驗動物對初次免疫和二次免疫的應答有明顯的不同。通常初次免疫應答往往比較弱，尤其是針對于易代謝，可溶性的抗原。首次注射后大約7天，在血清中可以觀察到抗體但抗體的濃度維持在一個較低的水平，在大約10天左右抗體的滴度會達到最大值。但同種抗原注射而產生的二次免疫應答的結果明顯不同，和初次免疫應答相比抗體的合成速度明顯增加并且保留時間也長。
 

免疫應答的動力學結果取決于抗原和免疫動物的種類，但初次和二次免疫應答之間的關系是免疫應答的一個重要特點。三次或以后的抗原注射所產生的應答和二次應答結果相似：抗體的滴度明顯增加并且血清中抗體的種類和性質發生了改變，這種改變被稱為免疫應答的成熟，具有重要的實際意義。通常在抗原注射4-6周后會產生具有高親和力的抗體。

新西蘭兔

不完全弗氏佐劑（IFA）完全弗氏佐劑（CFA）蛋白 KLH偶聯的多肽生理鹽水

注射器

一、實驗材料準備

1.  免疫動物：兩只新西蘭兔。
 

2.  佐劑：首先用完全弗氏佐劑（CFA），后用不完全弗氏佐劑（IFA）。
 

3.  免疫原：蛋白或KLH偶聯的多肽。每次免疫100-200 μg免疫原。

二、實驗步驟
 

1.  免疫

用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應的佐劑進行1:1混合。抗原和佐劑完全混合形成穩定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每個區域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應答。
 

2.  取血

用19號針頭對兔子進行耳動脈取血，室溫過夜析出血清。

3.  周期性免疫和放血

（1）第0星期

采血2 ml（獲得0.5-1 ml免疫前血清），完全弗氏佐劑（CFA）混合的200 μg抗原免疫兔。

（2）第2星期
 

完全弗氏佐劑（CFA）混合的200 μg抗原免疫兔。
 

（3）第4星期
 

不完全弗氏佐劑（IFA）混合的100 μg抗原免疫兔。
 

（4）第5星期
 

取檢測血清20-30 ml，取適當的細胞或組織進行ELISA和WB檢測，溶解在生理鹽水中的100 μg抗原免疫兔。
 

（5）第6星期
 

如果檢測陽性第一次采血20-30 ml，溶解在生理鹽水中的100 μg抗原免疫兔；如果上次檢測是陰性，取適當的細胞或組織進行ELISA和WB檢測。
 

（6）第7星期
 

第二次采血20-30 ml，溶解在生理鹽水中的100 μg抗原免疫兔；如果檢測仍為陰性，需要討論這個項目是否繼續。
 

（7）第8星期
 

第三次采血20-30 ml，溶解在生理鹽水中的100 μg抗原免疫兔。
 

（8）第9星期
 

末次放血20-30 ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150 mg抗體，最后進行ELISA和WB等質量檢測。
 

兔子需要保持9周的免疫和放血。