免疫堿性磷酸酶組織化學技術是以堿性磷酸酶（AKP 或 AP）取代 HRP 來顯示結果的免疫酶組織化學技術。最早出現的是間接免疫堿性磷酸酶法（IAP），1983 年 Mason 及 Moir 等建立了堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）復合物法。隨后，人們建立了更為敏感的生物素-親和素-堿性磷酸酶復合物（ABC-AP）法、S-P 堿性磷酸酶法、EnVisicm 堿性磷酸酶法以及用于原位雜交檢測的抗地高辛（Dig）、抗生物素（biotin）和抗熒光素（FITC）-AKP 檢測系統。因免疫堿性磷酸酶技術具有獨特優點，如敏感的酶底物顯色系統、染色背景低，故應用日益廣泛，尤其在原位雜交、TUNEL 等的檢測。
本實驗主要介紹間接免疫堿性磷酸酶（IAP）法和堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復合物（APAAP）法、S-P（AKP）法、EnVision 堿性磷酸酶法、PowerVision（AKP）法。
| 實驗方法原理 | 此方法的基本原理與 HRP-抗體間接法類似，所不同的是用 AKP 代替 HRP 標記第二抗體，將其制備成酶標記抗體。 |
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| 實驗材料 | 石蠟切片動物血清 |
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| 試劑、試劑盒 | 蛋白酶特異性一抗核固紅二甲苯乙醇樹膠PBSAKP 標記的二抗TBS（含左旋咪唑、MgCl2） |
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| 儀器、耗材 | 滴管玻片濕盒 |
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| 實驗步驟 |
1. 切片脫蠟至水，PBS 洗 3 min × 3 次。
2. 蛋白酶消化或 AR（組織抗原的暴露或抗原的修復，此步視情況而定）。
3. 滴加正常血清，阻斷 20 min（減少非特異性背錄染色），吸去多余血清。
4. 滴加適當稀釋的特異性一抗，37℃ 孵育 30～60 min 或 4℃ 過夜，PBS 洗 3 min × 3 次。
5. 適當稀釋的 AKP 標記的二抗 37℃ 孵育 30～60 min，PBS 洗 3 min×3 次。
6. 加入 0.02 mol/L（pH 9.0）TBS（內含 1 mmol/L 左旋咪唑，5 mmol/L MgCl2）阻斷內源性堿性磷酸酶。
7. 切片上滴加 50～100 μl 底物溶液（BCIP/NBT），室溫中濕盒內避光顯色 30 min～48 h，顯色 30 min 后鏡下觀察，待陽性充分顯示后水洗終止反應。
8. 充分水洗后用核固紅復染 5 min，沖洗后系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。
9. 結果觀察，背景呈紅色，陽性產物呈紫藍色。
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| 注意事項 | 1. 染色結果可根據不同的顯色底物而顯示不同顏色，如用堅固紅（FR/AS-MX）產生的底物為玫瑰紅色，用堅固藍（FB/AS-MX）則產物為紫綠色，而 BCIP/NB 丁為紫藍色。
2. 特別要強調的是，FR/AS-MX 和 FB/AS-MX 底物系統產生的顏色反應產物，能溶于有劑溶劑，如乙醇、二甲苯，所以不能用樹膠封片。 |
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