材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)裸 鼠 ， 6?8 周齡，無 特 殊 病 原（SPF)，或者是同基因型宿主（注射小鼠-小鼠雜交瘤時） 姥 鮫 焼（Pristane， 2,6，10，14-四甲基十五焼； Aldrich 公司提供） 雜 交 瘤（單 元 1.3) 添 加 10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L 丙酮酸鈉的 DMEM-10 完 全（附 錄 1 ) 培養基 PBS 或 HBSS，已消毒，不 含 FBS 1 0 % (m/V) 疊氮鈉 18 G 和 20 G 或 22 G 注射針頭 175 cm2 組織培養用細頸瓶 50m l 和 15 ml 塑料錐底離心管，無菌 Beckman 離心機和 TH-4 轉 子（或同等設備） IOml 注射器，無菌 56°C 水浴 0.45um 過濾裝置 1.于接種細胞前一周，用 20 G 或 22 G 針頭給每一只小鼠腹腔內注射姥鮫烷 0.5?lml。始終保證小鼠處于 SPF 設施中。遠交系裸鼠雖然更加昂貴，但無需放射線處理；不一定必須使用近交系裸鼠。 2.在盛有添加的 10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L 丙酮酸鈉的 DMEM-IO 完 全（附 錄 1)培養基的 175 cm2 培養瓶中增殖雜交瘤，保持細胞處于對數生長期。在 接 種 小 鼠（步驟 5 ) 之前，用 ELISA (單元 1 . 1 ) 或其他檢測方法檢測培養上清中 M A b 的活性，檢測最好在細胞擴增之前進行。為了降低病原體進入鼠類細胞克隆的風險，應該用抗 體 形 成 實 驗（CPI 單 元 1 . 1 ) 檢測細胞中的病原體。 3.將培養物移入 50 ml 錐底離心管中。室溫下， 500g離 心 5 min，棄上清。用 50m l 已消毒的不含 FBS 的 PBS 或 HBSS 重懸、洗滌細胞，并再次離心，棄上清。重 復 2 次后重懸細胞于 5 ml PBS 或 HBSS。 4.進行細胞計數，并用 臺 盼 藍 拒 染 試 驗（附 錄 3C) 檢測細胞活力是否接近 1 0 0 % 。加入 不 含 FBS 的 PBS 或 HBSS 調整細胞密度為 2. 5 XIO6 個細胞/ml。 5.用 IOml 注射器抽取細胞。使 用 22 G 針頭向裸鼠腹腔內注射 2m l 細胞 。注 射 3 只小鼠，通常至少會有一只且往往全部的小鼠都能產生含有 M Ab 的腹水。腹水的產生需1?2 周 ；若需要最大量的腹水應多等待 3?7d。 6.抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，繃 緊 腹 部 皮 膚（附 錄 2 0 。另一只手將一個18 G 的針頭刺入腹腔 1?2 cm。針頭刺入時應選擇左下腹或右下腹，避開上腹部的重要臟器和腹中線的大血管。在針頭刺入之前應先確保針的尾部已對準 15m l 塑料錐底離心管，流出的腹水可以直接滴入離心管中。 7.若操作中出現問題，可以參考以下解決辦法。 a. 若小鼠有大量的 腹 水 但 是 無 法 流 出 ，可 以 將 針 頭 緩 慢 地 旋 轉 ，或換一個位置插入。 b. 若沒有腹水積蓄且小鼠的健康狀況尚好，可以重新注射細胞。 c. 若沒有腹水積蓄且小鼠死亡（尤其是在注射后 2 周內發生死亡），下次注射時減少細胞的量。 d. 若形成了實體的腫瘤，將腫瘤細胞打散、重懸 ，并用以注射另一只姥鮫烷預處理的小鼠。 e. 若只形成了少量的腹水，將其注射另一只預處理的小鼠（大 約 〇 .5 ml/只）。 8.室溫下， 1500 g 離心腹水 IOmin。若液體在離心管內凝結，在離心前用細木棒在凝塊與離心管壁間刮一圈，若凝塊附在木棒上則將其丟棄，否則不做處理，離心后凝塊將成為沉淀的部分。 9.取上清，棄沉淀。在所有腹水收集完之前將先離心得到的腹水保存于 4°C (不超過一周）。 10.讓小鼠重新積蓄腹水（2?3d) ，按照步驟 6 再次提取腹水，按 照 步 驟 8 對腹水進行處理。多次重復提取腹水，直到不再有腹水生成或小鼠死亡。將剩余的小鼠處死(附錄 2 G)。 11.將之前多次抽取的腹水混合，在 56°C 水浴中熱滅活 45 min。若有凝塊形成，用步驟8 中的方法刮離、離心去除。 12.用適當的方法檢測腹水的 M Ab 滴度。以 大 于 1 : 1 0 的比例稀釋，并 用 0.45 um 過濾裝置過濾除菌。若不對腹水進行生物學檢測，則 加 入 1 0 % 的疊氮鈉溶液至總量的0 . 0 2 % 。分裝腹水 ， 一 70°C 凍存，并避免反復凍融，可以儲存數年。 展 | 