一、ELISPOT包被
1. 設計好實驗，把每個孔要加入的內容做成卡片，到時候就會從容很多。
2. 每孔加入15 μL 70%的乙醇預濕30秒。
3. 加入100 μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。
4. 按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50 μL，4°C包被過夜。
5. （次日）傾倒包被液，用PBS洗滌5次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。
6. 加入200 μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時。
7. 傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進行細胞培養。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數周。）
二、鋪細胞，加入刺激物，培養
整個實驗設置一組正對照（PHA刺激），每一個細胞樣品（同一個捐獻者或者實驗動物）要設一個負對照（不加刺激物），整塊板還要加一個背景負對照（不含細胞，只加培養基和所有的檢測試劑）。
1. 填好實驗卡片，用以指導實驗的安排和細胞及試劑的添加。每一個細胞/刺激物的組合設置2-4個孔的重復（想要有統計學的意義，每個細胞/刺激物設4個孔的重復）。
2. 取出封閉好的板，準備加入細胞。如果是以前做的封閉，可以加入200 μL的U-Cytech無血清培養基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復一次。
3. 按照實驗卡片的安排，加入不同濃度的細胞，100 μL/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細胞之后，不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓細胞更分散，實際情況剛好相反）。正對照的細胞濃度為1x105/well，實驗組的樣品細胞濃度請自行調整。
4. 加入100 μL的U-Cytech無血清培養基到背景負對照孔。
5. 正對照孔加入10 μL PHA，終濃度4 ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。
6. 加入實驗者自己的刺激物（配制成10×終濃度，10μL/well）到實驗孔。加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。
7.當加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24小時。
三、培養后操作
1. 傾倒孔內的細胞及培養基。
2.低滲法將細胞裂解，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。
3.每孔用200 μLPBST洗滌10遍，洗滌最后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干。
4.按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100 μL生物素標記的檢測抗體，37°C1小時。
5. 每孔用200 μL PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
6. 按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標的鏈霉親和素，每孔加入100 μL，37°C1小時。
7. 每孔用200 μLPBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
8. 照試劑盒的說明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。
9. 待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內，防止膜發脆、破裂。
10. 將ELISPPOT板置于ELISPOT自動讀數儀內，調節好合適的參數，半點計數，并記錄斑點的各種參數，作統計分析。 展開 | 